[发明专利]上皮细胞粘附分子的核酸适体及其制备方法

权利要求书

1.上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体分别命名为EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D与EpCAM Ccut，其序列如下：

EpCAMA：

agcgtcgaat accactacag tttggctctg ggggatgtgg aggggggtat gggtgggagt    60

ctaatggagc tcgtggtcag                                                80

EpCAM B：

agcgtcgaat accactacag agctcggggt tttttggggt tttttggggt tttggtgggg    60

ctaatggagc tcgtggtcag                                                80

EpCAM C：

agcgtcgaat accactacag aggttgcgtc tgtcccacgt tgtcatgggg ggttggcctg    60

ctaatggagc tcgtggtcag                                                80

EpCAMD：

agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc    60

taatggagct cgtggtcag                                                 79

EpCAM Ccut：

Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg。

2.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及基于上述结构做切短、延长、部分碱基替换的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有G四聚体结构或者茎环结构。

3.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成单链DNA随机寡核苷酸库；以Ni微珠为基质，筛选除去DNA随机寡核苷酸库中的非特异性结合部分，以上皮细胞粘附分子EpCAM微珠筛选得到与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列；

2）将步骤1）所得与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链酶亲和素微珠为基质进行分离，通过碱变性解链，过滤，纯化，即得用于次轮筛选的单链DNA文库，形成次一级核酸文库；

3）将步骤2）所得的单链DNA文库进行下一轮筛选，经过12轮筛选后获得目的寡核苷酸序列；克隆测序所述目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶蛋白结合的特异性和亲和力。

4.如权利要求3所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即为5'-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt-CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3'，库容量为10¹⁵以上。

5.如权利要求3所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述PCR扩增的引物为：

引物1：5'-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3'；

引物2：5'-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3'；

所述PCR扩增产物为3’端带有生物素标记、5’端带有FAM标记的双链DNA文库。

6.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体作为与表达EpCAM蛋白的细胞系的核酸适配体。