[发明专利]一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）真菌毒素为检测对象，利用三种光子晶体微球反射峰位置的差异对三种光子晶体微球进行物理编码，通过竞争免疫方法在光子晶体微球表面构建液相芯片检测新技术。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌分泌产生的，能引起人畜各种损害的次生代谢产物。到目前为至，已发现的真菌毒素高达500多种，并不断有新的真菌毒素被发现。其中，对人畜危害大、毒性强和污染频率高的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素B₁和M₁、展青霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏马毒素、桔霉素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。基于真菌毒素的严重危害，世界粮农组织和各国都严格制定了农产品、饲料和食品的真菌毒素残留最大允许残留量。人们一直努力采取各种预防措施，防止真菌毒素进入人类食物链。其中检测技术方法发挥着越来越重要的作用。一般地，真菌毒素的检测技术概括起来大体上分为三类：第一类是仪器分析法，包括薄层层析法、紫外、荧光分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用等。第二类是生物学检测方法，包括皮肤毒性实验、致呕吐实验、种子发芽实验等。第三类是基于免疫化学反应的检测方法，包括放射性免疫法、酶联免疫法（ELISA）、荧光偏振免疫分析、免疫凝聚法和免疫层析法等。这些技术方法在分析真菌毒素中起到非常重要的作用。然而，随着科技水平的提高，一些新的有毒有害物质不断被发现；同时，人们生活水平的不断提高，食品安全意识不断增强。这些都要求增加食品中有毒有害成分的检测种类，降低最大允许含量。另外，目前许多国家基于保护消费者健康或/和制造技术性贸易壁垒的目的，规定（或正在规定）必须同时检测农产品、食品和饲料中常见的多种真菌毒素。我国国家标准中也规定了农产品、食品和饲料中的黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素和桔青霉素的限量标准，其它更多真菌毒素的限量正在制定中。由于农产品样品及其污染源的多样性，对农产品及其制品的真菌毒素检测带来了巨大考验，尤其是对于大批量的样品检测，仅靠常规的上述检测方法已不能满足现场、快速、灵敏、稳定且低成本的需要。基于这些要求，研究和开发对仪器设备要求简单，试剂使用量少，对操作人员要求低，分析方法简便，成本低廉，准确、快速的真菌毒素多元检测技术和方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、成本低、检测时间快、特异性好的同时检测食品中多种真菌毒素新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）真菌毒素检测的方法。

本发明的原理如图1所示，在同一体系中，分别在粒径大小相同，反射光谱位置不同的光子晶体微球表面用双氧水：浓硫酸溶液进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，固定不同真菌毒素包被抗原，牛血清蛋白（BSA）封闭。包被的抗原与真菌毒素标准品或试样中真菌毒素竞争结合异硫氰酸荧光素（FITC）标记的各真菌毒素抗体。用荧光共聚焦扫描仪拾取各微球的荧光信号，用微球的反射光谱或其结构色识别不同的真菌毒素探针。建立标准曲线和检测食品中的真菌毒素。

本发明所述用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，是采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行直接竞争免疫检测多个真菌毒素，以黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）为检测对象，通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体与微球表面固定抗原竞争各自的抗原，利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码，对三种真菌毒素同时检测。

上述方法包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰；

（3）抗体标记：通过化学键合方法将黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）人工抗原固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面；

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测；利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码。