[发明专利]一种细胞培养基及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种细胞培养基，其特征在于，所述的该培养基是无血清无蛋白培养基，由基础培养基和补充因子构成；

所述的补充因子由无机盐类、氨基酸、维生素、其他物质组成，其含量分别为0.001~0.9%、0.001~0.035%、0.001~0.06%、0.001~0.4%。

2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的无机盐类是包括无水氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或七水硫酸锌中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的维生素是包括硫辛酸、维生素H、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺或维生素B₁₂中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的其他物质是包括D-葡萄糖、次黄嘌呤、酚红或胸苷等中的一种或多种。

6.根据权利要求1至5任一项所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该无血清无蛋白培养基的制造流程为：

（1）称取所有成分；

（2）溶解于10升纯水中，搅拌溶解；

（3）无菌过滤，即为成品无血清无蛋白培养基。

7.根据权利要求1至5任一项所述的细胞培养基作为培养CHO细胞的培养基的应用。

8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其特征在于，所述的无血清培养基培养CHO细胞的具体步骤包括：

（1）在本发明所述的无血清培养基中接种CHO细胞；

（2）在适合生长的条件下培养CHO细胞一段时间，即得所述的CHO细胞。

9.根据权利要求8所述的细胞培养基，其特征在于，所述的适合生长的条件是37±2℃，5±1%二氧化碳，所述的一段时间是1-3周。

10.根据权利要求8所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该CHO细胞用于制备抗CD20单克隆抗体，其制备方法包括如下步骤：

（1）构建一个独特的pMED高效哺乳动物细胞基因表达系统；

（2）建立一个悬浮细胞、无血清培养驯化体系，通过转染将CD20单抗基因整合到CHO细胞的基因组中，通过逐步增加MTX的浓度使整合在细胞内的目的蛋白基因拷贝数大量扩增，筛选CHO细胞亚克隆，获得高表达工程细胞株，并建立三级种子细胞库；

（3）建立适合哺乳动物细胞悬浮培养的无血清培养基，使用该无血清CD培养基培养CHO工程细胞株；

（4）建立哺乳动物细胞大规模培养及蛋白纯化体系，利用哺乳动物细胞大规模发酵及纯化平台，获得外源蛋白的大规模表达。

11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该抗CD20单克隆抗体的有关测定情况如下：

（1）N端氨基酸序列测定

测序结果为Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，该结果与文献报道的美罗华一致；

（2）C端搭配序列测定

测序结果为Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His，该结果与文献报道的美罗华一致；

（3）肽图分析

肽图图谱与对照品美罗华一致；

（4）分子量测定

测得的分子量还原型介于63~77KD，非还原型约为150KD，与对照品及文献报道的美罗华一致；

（5）等电点测定

测得的等电点分布在4.8±0.5内，与对照品及文献报道的美罗华一致。

12.根据权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述的CHO工程细胞株是中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44。