[发明专利]嗜肺军团菌快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体是一种利用荧光PCR熔解曲线鉴定嗜肺军团菌的方法。

背景技术

军团菌是一种兼性胞内寄生菌，是引起人类军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有爆发流行，我国已将其列入14种新发传染病之一。据国外报道，院内不明原因肺炎感染有10％是由军团菌引起。目前已知军团菌有52个种，70多个血清型。但临床上80%以上军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。因此，嗜肺军团菌的鉴定对于军团菌病诊断具有重大价值。

目前军团菌的检测鉴定方法主要有分离培养、血清抗体检测、尿可溶性抗原检测，此外，还有分子分型检测技术，主要包括传统的聚合酶链反应（PCR）电泳及探针杂交检测方法、扩增长度多态性分析（AFLP）、限制性片段长度多态性分析（RFCP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、限制性酶切分析、DNA测序分析等。但以上的检测方法均存在不足，如直接分离培养，所需时间长达3～10天，阳性率低，培养基配置复杂，价格昂贵；尿抗原检测仅对嗜肺军团菌血清型1型具有特异性；分子分型技术虽然在很大程度上提高了军团菌检测的敏感性和特异性，但仍然存在各自的缺点，如传统的PCR检测操作繁琐、耗时长、易污染；基于荧光共振能量转移原理的杂交探针标记技术价格昂贵、操作复杂；DNA测序是最为准确的军团菌种鉴定方法，但耗时较长，分析困难，不能适应临床上的快速要求，其他分子检测方法均存在各种不足。

发明内容

本发明基于荧光共振能量转移原理，根据嗜肺军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物和探针，选取一种猝灭荧光基团代替原有的杂交探针荧光标记物，建立新型的实时荧光PCR熔解曲线法对嗜肺军团菌进行鉴定。

本发明是这样实现的：一种嗜肺军团菌快速鉴定方法，基于荧光共振能量转移原理，选取一种猝灭荧光基团，建立新型的实时荧光PCR熔解曲线法对嗜肺军团菌进行鉴定。

进一步地，所述鉴定方法的步骤如下（1）至（4）所列，

（1）实时荧光PCR反应建立中所采用的一对引物和一对探针：

上游引物：5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，

下游引物：5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’，

锚定探针：5’-CCCATACTCGAGTCAACC(FAM)-3’，

猝灭探针：5’-(BHQ1)TATTATCTGACCGTCCCAG(ph)-3’；

（2）提取DNA：取痰液标本1ml加等量0.1%二硫苏糖醇痰消化液处理，37℃下放置30min，离心沉淀，于沉淀物种中加入自配的基因组DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，上清液即是基因组DNA模板；

（3）以上取得的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR反应程序：先95℃预变性3min，再95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸30s，进行50个循环；

（4）检测结果判定，熔解曲线分析程序为：95℃ 1min；40℃ 2min；以1℃/5s的速度，从40℃升温至85℃，嗜肺军团菌的Tm值均为57℃，其它非嗜肺军团菌及非军团菌均无57℃的Tm值。

所述PCR反应体系如下：

本发明为一种嗜肺军团菌的快速鉴定方法，它采用一对军团菌特异引物扩增16S rRNA基因上的区域，在该扩增片段（386bp）内针对嗜肺军团菌特异序列设计一对杂交探针，锚定探针3'端标记FAM荧光基团；猝灭探针5'端标记BHQ1，3'端磷酸化；通过实时荧光PCR熔解曲线猝灭基团代替原有的杂交探针荧光标记物分析来检测样本中的嗜肺军团菌。

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件建立的嗜肺军团菌新检测方法，其主要特点如下：

（1）高特异性：本发明通过对16株嗜肺军团菌（包括15个血清型）、35株非嗜肺军团菌及12株其它非军团菌进行基因分型检测，该方法能准确的鉴定出嗜肺军团菌，说明该方法是一种特异性很高的嗜肺军团菌检测方法；

（2）高敏感性：本发明建立的熔解曲线分析方法，大大提高了检测的敏感性。通过限制性稀释法，发现该方法最低检测限度达到100fg/μl；

（3）高稳定性：根据嗜肺军团菌特异性靶序列设计的探针，标记荧光基团及荧光猝灭基团来检测嗜肺军团菌，结果稳定可靠；

（4）检测方法闭管操作，简便快速；