[发明专利]实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测鸡高迁移率族蛋白B1的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及定量RT-PCR检测试剂盒，主要涉及一种实时荧光定量RT-PCR检测鸡高迁移率族蛋白B1试剂盒。 

背景技术

高迁移率族蛋白（HMG）最早由Johns于20世纪70年代在小牛胸腺中发现，是种几乎存在于所有真核细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其分子质量小（<30kD），在聚丙烯酰胺凝胶电泳快速迁移而被命名为高迁移率族蛋白（HMG蛋白）。根据分子质量大小及DNA结合特性，HMG族蛋白分为HMGA，HMGB，HMGN家族；HMGB又分为HMGB1和HMGB2。HMGB1在进化过程中高度保守，在所有哺乳动物中有99%同源性。HMGB1分子包括3个功能区：含与DNA结合的结构域A盒（1aa～79aa）和B盒（89aa～163aa），及1个高度重复并富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸的C-末端（186aa～215aa）。其中，B盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点。A盒蛋白（A-box）能取代全长HMGB1而与相应受体结合，但不发挥生物学效应，故纯化的A-box可作为HMGB1特异性拮抗剂。HMGB1广泛分布于淋巴、心、肝、肺、脑、脾、肾等组织，在肝和脑组织中HMGB1主要存在于胞浆，而大多数其他组织中存在于细胞核内。在这些细胞核中，HMGB1和HMGB2结合于DNA双螺旋小沟内，引起DNA构象变化。这种结合无序列选择性，可以帮助特异性DNA结合蛋白正确装配到其在染色体内的结合位点。 

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box B1，HMGB1），是一种典型的危险因子，正常情况下表达于胞核和胞浆内的非组蛋白染色体结合蛋白，参与多种生物学过程包括基因转录、DNA修复、V（D）J重组（胚系基因片段重组）、分化和发展。其功能主要为：①使双螺旋极度扭曲以便各种转录因子和染色质相互作用；②调节类固醇激素受体、NF-κB、p53及RAG1重组酶的转录活性；③与组蛋白作用而影响染色质结构，使染色质解螺旋。HMGB1非特异性与DNA结 合，可通过核孔而穿梭于胞核与胞浆之间。HMGB1仅在危险信号出现时释放至胞外发挥作用。胞外HMGB1不仅可直接充当炎性细胞因子参与固有免疫效应，也可作为内源性DAMP激活APC，从而启动、增强适应性免疫应答，并参与多种疾病过程发生和发展。HMGB1过表达有抑制细胞凋亡，诱导细胞分化、细胞迁移、细胞增殖等作用。因此，HMGB1可能作为干预多种免疫相关疾病的重要靶标。目前已发现的HMGB1的重要受体包括晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Tol l样受体2（toll like receptor2，TLR2）、TLR4。新近研究表明它也不但是一种转录因子和促生长因子，而且是一种重要的炎性细胞因子，并与肿瘤的发生、浸润、转移等生物学行为关系密切，有很重要的临床价值。本课题组前期的蛋白质组学结果也显示chHMGB1在J亚群禽白血病（ALV-J）感染的细胞中蛋白表达水平有差异，故推测chHMGB1在ALV-J感染致病过程中发挥一定的作用。 

目前对于chHMGB1的研究还处于起始阶段，各种检测chHMGB1表达的方法还很欠缺。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测蛋白基因表达已成为可能。Real-time PCR方法有着比ELISA等传统方法无法比拟的高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量。因此运用Real-time PCR技术对chHMGB1进行实时的定量检测，为深入研究chHMGB1具有重要作用。 

发明内容

本发明提供了一种实时荧光定量RT-PCR检测鸡高迁移率族蛋白B1试剂盒。可以精确定量检测标本中鸡高迁移率族蛋白B1(chicken high mobility group box 1,chHMGB1)的mRNA表达量。 

本发明试剂盒包含:逆转录反应液(RT反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV逆转录酶)、RNA酶抑制剂(Rnasin),PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、Subgreen荧光染料、标准品、对照品。 

其中逆转录(RT)反应液含有焦碳酸二乙酷处理的水(DEPC-H₂O)、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)缓冲液、寡举(dT)_15-18(Oligo(dT)_15-18)、dNTPs。