[发明专利]一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒，尤其涉及一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

地中海贫血(thalassem ia)简称“地贫”，是世界上最常见的血液遗传病之一。地中海贫血临床表型多样，由轻到重，可以从正常到反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的精神及经济负担。而且，目前医学上尚无有效的治疗措施；因此，控制和降低地贫患儿的出生率才能有效地监控此类疾病的发生。通过人群筛查和遗传咨询，对那些携有地贫基因的育龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断和基因诊断，是现实条件下控制重症地贫患儿出生最有效的途径。

地中海贫血是自体隐性遗传疾病，因珠蛋白链的合成障碍所产生，表现为红细胞体积较小和寿命缩短。通常根据珠蛋白链的种类将地中海贫血分为α、β、γ、δβ等类型,其中以α、β地中海贫血最为常见，而β地中海贫血危害最大。其中，β-地中海贫血是一种以珠蛋白肤链合成缺陷为特征的遗传性溶血性贫血，主要为β珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。目前全世界已发现的β-地中海贫血突变约170种，在中国人中已发现21种。大量的研究结果表明β-地中海贫血基因突变及频率分布具有明显的种族特征及地域差异。医学统计发现中国人常见的突变依次为：CD41-42缺失突变（41.6%）、IVS-2nt654（C→T）突变(21.8%)、CD17（A→T）无义突变（18.0%）、TATA盒nt-28（A→G）突变（8%）、CD71-72（+A）移码突变（3.9%）、TATA盒nt-29突变（1.2%）；这六种突变的基因频率占中国人地贫基因的94%以上，其中CD41-42缺失突变是中国人最常见的突变类型。因此，对相关基因型进行准确的诊断，对于β-地中海贫血诊断和和防治具有重大的意义。

现有技术中已有的β地中海贫血常用分子诊断方法包括：PCR结合特异寡核苷酸探针(PCR-ASO)斑点杂交法、反向杂交(RDB)法、突变寡聚核苷酸延伸扩增PCR(mutant oligonu2cleo tide extension amplification,MOEA)技术、多重等位基因特异PCR(multiplex allele specific PCR,MAS-PCR)法、等位基因特异性扩增技术(allele specific,A SPCR)、基因芯片法等。其中，PCR结合特异寡核苷酸探针(PCR-ASO)斑点杂交法一次检测只针对一种突变，一般完成未知样品的诊断通常需多次重复检测，所以颇为费时费力。反向杂交(RDB)法存在PCR扩增不良，杂交膜条上探针太弱或膜条洗涤不充分等原因，会导致假阳性或假阴性结果的出现。突变寡聚核苷酸延伸扩增PCR技术较适于检测已知DNA点突变的β地中海贫血，需进行电泳，较费时费力。基因芯片法简便、快速、微量化、自动化、一次能平行筛查更多甚至全部已知突变类型的新方法，但需购进昂贵的仪器设备进行检测，难以推广普及。

实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

因此，结合荧光定量PCR技术的诸多优点，开发出一种能够快速、准确、高敏感度的检测β-地中海贫血基因特定位点突变的荧光定量PCR检测试剂盒是业界亟待解决的技术问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，能够快速、准确、高敏感度地检测β-地中海贫血基因的突变情况，尤其是针对中国人常见的6种β-地中海贫血基因特定位点突变。