[发明专利]小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及小球藻深加工及生物技术领域，具体涉及小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。

背景技术

小球藻(Chlorella pyenoidosa) 是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门、小球藻属，生长速度快，易于培养，应用价值高. 小球藻含有丰富的生物活性物质和药用成分，作为一种新型保健食品和药物蕴藏着巨大潜力。小球藻具有抗肿瘤活性、增加免疫力、解毒保肝、降压作用等，其粗蛋白含量高 (50%左右),品质好，已经成为小球藻应用领域十分活跃、备受重视的一个方面。

生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽类。绝大多数蛋白质都是具有一定功能作用的生物活性肽的前体物质，其肽链结构中存在着具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能区)，在正常状态下，其功能区肽段隐藏在肽链中，但一旦单独从蛋白质肽链中释放出来，在适当的环境下，就能显示出独特的生物活性，这个功能肽段就是生物活性肽。现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，目前已有的抗肿瘤药物虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在着治疗效率低、选择性差、毒副反应大、易产生瘤细胞耐药等问题。因此，从不同途径寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍是药物治疗肿瘤的当务之急。近年来，人们越来越重视生物活性肽的研究和开发，各种生物活性肽不断被发现和制备，多肽类药物因其分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小，其抗肿瘤活性的研究正在引起国内外学者的广泛关注。

蛋白及其多肽类药物在药物投递过程中极易受到复杂生理环境特别是大量酶类物质的作用而遭到破坏，另外其较弱穿透能力及天然脆性决定了较易丧失本身的活性，为了提高多肽的生物利用度，抵抗胃酸和胃蛋白酶的降解作用，必须对其进行适当的保护，使其在小肠内稳定的发挥作用。壳聚糖无毒，具有良好的生物相容性、可降解性、成膜性和可塑性.壳聚糖还具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性。因此，壳聚糖的应用日益受到人们的重视，在食品和生物医药领域具有广阔的前景。特别对于生物活性肽, 壳聚糖包埋可望提高其稳定性和生物利用度，达到更好的营养功能和生理功效。

发明内容

为拓展小球藻在食品和生物医学领域的应用，本发明的目的是提供小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

1、小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，具体包括如下步骤： 

（1）将小球藻粉和纯水混合后搅拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白质，得到的粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，将获得的溶液离心，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉。                          

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为1~4%（w/v，g/mL）的小球藻蛋白水溶液，加水解酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后,经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为＜3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。

 (3) 以步骤（2）得到的3-5 KD小球藻多肽水解液为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化，按照出峰顺序共收集到四个峰A1~A4， 将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化，按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2。

(4) 以步骤（3）得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础,再采用三聚磷酸钠（TPP）离子交联法即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。

上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述小球藻粉和纯水的质量比为1:10～1:40,所述搅拌时间为30～120分钟。

上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述提取小球藻蛋白质为在温度4℃～10℃、压力50MPa～250MPa的条件下提取。

上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述再提取所提取的次数为1次～8次，每次提取的时间为10min～60min；所述离心为在温度4~8 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min。