[发明专利]一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法。

背景技术

生物碱是广泛存在于植物体内的一类由小分子含氮化合物组成的次生代谢产物，目前世界上已有超过12000种的生物碱类物质被分离鉴定。生物碱在烟草及其制品中有特殊的地位，它不仅是烟草重要的品质要素，而且规定了烟草作为一种商品的特质。烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱是烟草中的4中主要生物碱。人们吸食烟草主要是吸食其中的烟碱(nicotine)，又名尼古丁。普通烟草属于烟碱积累型，烟碱含量占总生物碱含量的90～95％，另外3种仅占生物碱总含量的5％～10％，降烟碱含量一般不超过总生物碱含量的3.5％。

普通烟草是纯合双隐性基因型(ctctcscs)，不具有烟碱去甲基能力。但在栽培品种的烟株群体中，一些植株会因为基因突变而具有烟碱去甲基能力，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量则相应增加，甚至可以达到95％以上。这种烟碱向降烟碱转化的性状称为烟碱转化，具有烟碱转化能力的烟株称为转化株(converter)。

降烟碱含量的升高会直接影响烟叶的香吃味品质，导致烤烟调制后出现“樱红”现象且香味不佳。同时由于降烟碱易于在烟叶调制和调制后的陈化过程中发生氧化、亚硝化和酰化等生化反应，形成许多有害成分，如麦斯明(myosmine)、酰化降烟碱(acylnornicotines)和亚硝基降烟碱(NNN)等，因此降烟碱含量的升高对人体健康也存在不利影响。

控制较低水平的降烟碱不仅是因为它作为许多有害成分的前体物质对人体具有潜在的致癌性，还因为降烟碱本身对人体的健康也具有负面影响。降烟碱可以导致蛋白质的异常糖基化，而且还可同许多常用的类固醇药物(如强的松)发生共价反应，从而改变这类药物的药效和毒理。

因此，及时剔除烟草群体中的转化株从而控制较低水平的降烟碱含量成为国际烟草工业界和学术界关注的热点问题之一。

目前检测烟草烟碱转化水平的方法主要是通过气相色谱法(GC)和气质联用法(GC-MS)检测其生物碱组分与含量，进而计算烟碱转化水平。虽然该方法稳定性、可操作性都比较好，但该方法通常仅能分析采收后的成熟烟叶或调制后的烟叶，且采收后需要一定的处理，较为耗时，无法在整个生育期动态了解不同品种烟叶及同一品种的不同群体内的烟碱转化水平，进而无法及时地将不良转化株淘汰。

发明内容

本发明提供了一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，利用该方法可以简便快速检测同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间烟碱转化相对水平。

一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，包括如下步骤：

(1)收集同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片；

(2)分别提取所述叶片的总RNA，逆转录合成cDNA；

(3)针对烟碱转化相关基因设计特异性引物，以所述cDNA为模板，利用所述特异性引物进行实时荧光定量PCR，得到各自的Ct值；

(4)根据所述Ct值，利用标准曲线计算得到各cDNA中烟碱转化相关基因的模板量，判断同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间的烟碱转化相对水平；

所述特异性引物为：

上游引物：5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’；

下游引物：5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’；

所述烟碱转化相关基因为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4，其全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在检测同一烟草品种不同部位或不同烟草品种的叶片烟碱转化相对水平时，一般选用成熟期叶片。

烟碱去甲基化酶基因CYP82E4是CYP82E2基因家族的成员，介导烟碱向降烟碱的转化。该基因家族尤其是烟碱去甲基化酶基因CYP82E4在烟草转化株中的转录水平普遍高于非转化株，使用RNAi干扰技术抑制该基因的表达，可以有效降低高降烟碱含量烟草在烟草转化株的比例。因此，针对该基因设计方法，能准确灵敏地检测烟草烟碱转化相对水平。

本发明实时荧光定量PCR所扩增的并不是烟碱转化相关基因的全序列，而仅仅是其中的某一片段，其碱基序列如SEQ ID No.4所示。逆转录过程中，各组所取RNA的体积及浓度是相同的，通过计算烟碱转化相关基因的模板量(浓度)，就可以得到该基因的表达水平。

所述实时荧光定量PCR采用SYBR Green I荧光嵌合法。