[发明专利]一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法

权利要求书

1.一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)收集同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片；

(2)分别提取所述叶片的总RNA，逆转录合成cDNA；

(3)针对烟碱转化相关基因设计特异性引物，以所述cDNA为模板，利用所述特异性引物进行实时荧光定量PCR，得到各自的Ct值；

(4)根据所述Ct值，利用标准曲线计算得到各cDNA中烟碱转化相关基因的模板量，判断同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间的烟碱转化相对水平；

所述特异性引物为：

上游引物：5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’；

下游引物：5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’；

所述烟碱转化相关基因为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4，其全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR采用SYBR Green I荧光嵌合法。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的扩增体系为20μL，其中：Takara 2×SYBR Premix EX Taq 10μL、10μM正反向引物各0.5μL、cDNA模板2μL、灭菌蒸馏水7μL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的制备方法为：

(1)制备一组浓度呈梯度分布的标准品；

(2)以所述标准品为模板，利用权利要求1所述的引物，进行实时荧光定量PCR，记录Ct值；

(3)绘制得到标准曲线；

所述标准品为含有烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA核苷酸序列的重组载体悬液，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞悬液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组载体的制备方法为：

(1)提取烟草叶片总RNA，并反转录为cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的片段；

(3)将所述目的片段连入T载体，获得重组载体。

所述PCR扩增所使用的引物为：

上游引物为：5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’；

下游引物为：5’-TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3’。