[发明专利]一种人类粒细胞抗原（HNA）1-5系统基因分型的PCR-SBT方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人类粒细胞抗原（Human Neutrophil Alloantigens，缩写为HNA）1-5系统抗原基因分型的分子生物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂。

背景技术

人类白细胞膜上具有一系列的血型抗原，包括粒细胞特异性抗原和人类白细胞抗原，这些抗原在不同人群中表现出高度的多态性，输注后由于个体抗原的差异可以刺激不同的机体产生免疫反应，从而引发某些输血不良反应，导致输注无效或引起某些严重的疾病，因此研究粒细胞特异性抗原具有重要的临床意义。目前国际输血协会的粒细胞抗原工作组制订了人类粒细胞特异性抗原（Human Neutrophil Alloantigens）的命名原则，粒细胞特异性抗原系统被称“HNA”。命名原则中作为抗原糖蛋白的定位用阿拉伯数字表示，如HNA-1定位于FcγReceptor Ⅲb；同一糖蛋白不同的多态性则根据发现先后顺序用小写英文字母表示（如HNA-1a，HNA-1b、HNA-1c等）。目前研究发现的粒细胞特异性抗原系统（HNA）有7个抗原，归属于5个人类粒细胞抗原系统。

个体粒细胞特异性抗原的差异可以导致输血后产生粒细胞抗体，目前证实粒细胞抗原、抗体在多种临床疾病中起重要的作用，包括新生儿同种免疫性粒细胞减少症、自身免疫性粒细胞减少症、发热性非溶血性输血反应、输血相关性急性肺损伤（TRALI）、骨髓移植后同种免疫性粒细胞减少症、输血相关性同种免疫性粒细胞减少症、药物诱导的粒细胞减少症和粒细胞输注无效等。其中粒细胞抗体与TRALI的关系近年来受到血液领域的高度关注，国外研究发现粒细胞特异性抗体与TRALI的发生密切相关，大多数发生TRALI的病例均能检测到粒细胞特异性抗体，而且存在抗原系统的差异性。TRALI是临床输血并发的急性呼吸窘迫综合症，是一种严重的输血不良反应，患者可发生急性呼吸困难、低氧血症、非心源性肺水肿、低血压和发烧，其死亡率较高，是输血反应并发死亡的主要原因，目前已成为输血反应引起死亡的第二位原因。现有关粒细胞特异性抗原系统与TRALI的关系以及TRALI的预防已成为输血领域的研究热点之一，近年国外部分国家已开展在献血人群中系统检测粒细胞特异性抗原系统的研究，以期预防和减少TRALI的发生。

目前粒细胞特异性鉴定方法主要有血清学方法和基因分型方法。血清学鉴定粒细胞抗原或抗体方法主要有粒细胞凝集试验、粒细胞免疫荧光试验（GIFT）、单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕获试验(Monoclonal Antibody Immobilization of Granulocyte Antigen，MAIGA)、流式细胞术和ELISA等方法。粒细胞抗原系统的基因分型方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SSO等。Bux等的实验表明，基因分型法与MAIGA方法对HNA的分型具有同样的可靠性，而GIFT有15%的分型失误率。

目前的HNA抗原基因分型最主要的方法是PCR-SSP（PCR-序列特异性引物），该方法需要进行多管扩增，并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的HNA抗原进行基因分型，对于一些特殊的新突变位点则难以明确。而HNA的PCR-SBT（PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术）分型方法可以克服上述缺陷和局限性，为最准确的分型的方法。但现阶段的HNA抗原基因PCR-SBT分型方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对HNA个别抗原进行基因分型，但至今未对HNA五个系统进行系统分型。因此，建立HNA1-5系统的PCR-SBT分型方法具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HNA1-5系统抗原分型的PCR-SBT方法，以克服现有基因分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案：

它对五个HNA抗原系统的基因进行分型，包括以下步骤：

（1）制备人基因组DNA；

（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系统的基因序列；

（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；

（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；

（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。