[发明专利]一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的引物及方法。

背景技术

植酸，即肌醇-六磷酸，是禾谷类种子中含磷最丰富的化合物，占到种子干重的1％以上，占种子全磷量的75.0±10％。植酸通常与Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等金属阳离子螯合成植酸盐，并与蛋白进一步形成球状复合体，沉积在禾本科作物籽粒的糊粉层中。由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)体内不含植酸酶，食物中的植酸难以被消化利用，即降低了磷元素的有效吸收，也影响微量元素、蛋白质和淀粉的生物有效性。因此，植酸是一种典型的抗营养因子。此外，植酸随动物粪便排泄到环境中，极易引起水体富营养化，造成严重的环境污染，特别是在饲养业发达的国家尤为严重；另一方面为了满足动物生长发育的需要，饲料中往往要额外添加有机磷或骨粉等，提高了饲养成本。因此，降低作物种子中植酸的含量日益成为育种学家、营养学家和环境学家关注的焦点。运用理化诱变和基因工程技术，创制种子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可从源头上解决上述问题。

迄今，国内外学者已从水稻、大豆、玉米、大麦、小麦等作物中获得了一批LPA突变体，培育出了一些LPA作物新品种，如在大麦中已育成和推广了2个LPA新品种：‘Herald’和‘Clearwater’。临床和动物饲养实验证实，人对食物中的Zn²⁺的吸收与LPA玉米籽粒中植酸盐下降的程度成正比；LPA大麦或玉米作为饲料，不但Fe³⁺和Zn²⁺的有效性增加，而且可以提高大麦和玉米用做饲料时动物对磷的利用，从而减少动物粪便造成的磷污染。

目前获得LPA突变系的主要途径是理化诱变和自然筛选，并且只能收获作物成熟种子后才能通过微量测定方法检测个体种子无机磷含量，初步筛选高无机磷品系，然后根据材料表型及实验条件进一步通过铁沉淀等方法测定植酸磷和全磷含量，选育周期较长，成本高，且效率低。

随着现代分子生物学理论和技术的快速发展，利用正向(图位克隆)或反向遗传学(RNAi，T-DNA插入突变)技术，已报道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK，MRP，2-PGK，IPKl)，不仅揭示了LPA突变发生的分子机制，也为基于LPA相关基因核苷酸变异的引物在LPA作物新品种的选育方面奠定了理论基础。因此，充分利用已有的LPA基因资源选育LPA水稻新品种是今后水稻功能性成份育种的一个重要组成部分。

水稻是我国及世界上三大粮食作物之一。作为稻米生产和消费的大国，我国也是铁缺乏和缺铁性贫血等微量元素缺乏症发生较严重的国家之一，而降低水稻植酸含量可显著提高Fe³⁺、Zn²⁺等微量元素的生物有效性。因此，若能获得与目的基因共分离的基因功能性引物，有效快速鉴定含有目的基因的LPA水稻种质资源，培育具有营养与环保双重功能的LPA水稻在我国就有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明提供了一种引物，利用该引物可以方便地鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代的基因型。

一种引物，正向引物为ZW3F和ZW4F，反向引物为ZW3R；

ZW3F：5’-AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3’

ZW4F：5’-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3’；

ZW3R：5’-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3’。

水稻低植酸突变体zju-lpa3低植酸含量性状受2-PGK(LOC Os02g57400)等位突变基因ZJU-LPA3控制，基因组外显子和内含子上缺失了一个1475bp大片段。据此，在TIGR V7.0网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载对应的核苷酸序列，并对序列进行比对分析，利用Primer Premier 5.0软件在水稻低植酸基因ZJU-LPA3突变体缺失片段区域附近设计相应的引物ZHJ3，引物ZHJ3的反向引物和一个正向引物根据基因2-PGK的保守区域设计，另外一个正向引物是根据基因ZJU-LPA3缺失片段区域设计，具有较好的通用性和特异性。

本发明还提供了一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的方法，包括如下步骤：

(1)提取水稻样品苗期叶片的总DNA；