[发明专利]虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物。

背景技术

虹鳟肠炎红嘴病(Enteric redmouth disease，ERM)又称为肠性红嘴病、鲑鳟鱼血点病，由鲁氏耶尔森氏菌感染引起，主要经口传染。由于皮下出血导致嘴及咽喉发红，外部症状表现为下颌发红或溃烂，体色变黑，鳍基充血，两侧眼球外突，活动迟缓，食欲下降或绝食，肌肉、体内脂肪及消化道出血，有时消化道积黄色液体，肾脏及脾脏微肿。该病主要在虹鳟养殖区流行，危害体长为7.5厘米以下的鱼体，对虹鳟养殖产业造成了严重经济损失。

该病易与虹鳟弧菌病、疥疮病混淆。目前对该病的检测主要是根据其临床症状来推测，准确率相对较低，容易导致误诊。对病原菌则主要是采用传统的生理生化鉴定方法，耗时耗力且准确率不高，因此有必要研究一种针对该病原的快速、灵敏、可操作性强的检测方法，以便用于ERM的早期诊断。

发明内容

本发明是要解决现有的虹鳟肠炎红嘴病的检测存在耗时耗力且准确率不高的问题，而提供虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物。

虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列为TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R  的核苷酸序列：ACATTTCACAACACGAGC。

虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行：一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登录号：AB681666.1)，利用Primer Primier 5设计一对特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；二、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测；

其中步骤一中特异性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列：5’-TGGAGGGGGATAACTACT-3’；下游引物YR-R  的核苷酸序列：5’-ACATTTCACAACACGAGC-3’。

本发明设计的特异性引物YR-F/YR-R可有效扩增鲁氏菌16S rRNA基因片段，其检测精度达到10pg的模板DNA，且检测成本相对较低。

本发明虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法操作简单，可迅速诊断虹鳟红嘴病，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好。

本发明虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法从样品采集、细菌培养到菌落PCR鉴定所需时间不超过24h，结合病鱼临床病症，可迅速准确的诊断虹鳟鱼肠炎红嘴病。

附图说明

图1为实施例中鲁氏耶尔森氏菌16S rRNA基因PCR扩增结果的电泳图，其中M：DL2000marker，泳道1：以鲁氏菌基因组DNA为模板，泳道2：阴性对照；

图2为对照实验中PCR特异性试验结果的电泳图，其中M：DL2000marker，泳道1～泳道4：分别以鲁氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增；

图3为PCR敏感性试验结果的电泳图，其中M：DL2000marker，泳道1～泳道6，模板浓度依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg，泳道7：阴性对照。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列为TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R的核苷酸序列：ACATTTCACAACACGAGC。

具体实施方式二：采用具体实施方式一中所述引物进行虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行：一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登录号：AB681666.1)，利用Primer Primier 5设计一对特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；二、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测；