[发明专利]非限制性构建无缝质粒表达载体的方法

权利要求书

1.非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，包括如下步骤：

(1)依据目的片段的DNA序列和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列；

(2)PCR引物设计：设计两对含有dU的PCR引物；

a.第一对引物用于扩增目的DNA片段：

设计方法是根据重组质粒DNA序列在插入目的DNA片段与质粒载体之间5′端和3′端靠近接缝处各找一长度为6-11个碱基序列作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区；5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区是第一个碱基为A，最后一个碱基为T的DNA序列；设计正向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；

b.第二对引物是用来扩增质粒载体：

正向引物设计方法是使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补；

(3)PCR扩增：使用上述设计的两对引物，分别以含有目的DNA片段的质粒和载体质粒作为模板，采用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增分别得到目的片段DNA和质粒载体DNA；PCR产物用20个酶活单位的Dpn I酶37℃水浴1-2h以去除模板DNA；

(4)用USER酶处理步骤(3)产物：取10个酶活单位的USER酶加入步骤(3)Dpn I酶处理后无需纯化的产物中，37℃水浴1-2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；

(5)将步骤(4)得到的具有粘性末端的目的DNA片段和质粒载体的混合物按体积比3∶1的比例混合转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂到含抗生素的培养基平板上筛选阳性菌落；

(6)用菌落PCR方法鉴定阳性菌落，挑取阳性克隆子送测序中心测序。

2.根据权利要求1所述的非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，其特征在于，将目的DNA片段插入任何质粒载体或置换质粒载体的任何部位构建重组质粒。