[发明专利]一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及结核分枝杆菌利福平耐药性检测方法，提出一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法。

背景技术

近年全球范围内，发达国家和发展中国家都出现结核病流行的大回升。据统计，全球已有1/3(约20亿)人感染了结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发生约900万病人，每年死亡人数高达300万。而耐多药结核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)/广泛耐药结核病(Extensively drug-resistanttuberculosis，XDR-TB)的涌现，更是对全球公共卫生安全构成了严重威胁，大大增加全球结核病控制的负担。据WHO资料显示，中国现有的耐药结核病患者数占全球20%左右，结核病依然是中国三大传染病之一，防治仍然面临着严峻的挑战。2007—2008年全国结核病耐药基线调查显示：我国肺结核病人中耐多药率为8.32%，广泛耐药率为0.68%。据此估算，我国每年新发耐多药(MDR)肺结核患者12万例，而人员迁移流动、城市居住条件拥挤不堪等现况加剧了它的发生。

目前结核病最常用的诊断方法已有100多年的历史，抗结核病药物在过去50年间没有变化，遏制耐药结核病蔓延需要创新理念，而更深入地了解抗结核药物以及结核分枝杆菌的耐药机制对于更好地预防和控制结核的蔓延是非常必要的。

利福平自1972年首次作为抗结核药物以来，一直发挥着巨大的杀菌效力，它是目前一线抗结核药物中最重要的药物之一。利福平抗菌谱广且作用强大，对静止期和繁殖期的结核菌均有作用，能增加链霉素和异烟肼的抗菌活性。它通过作用于结核分枝杆菌的RNA聚合酶β亚基，抑制RNA聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。RNA聚合酶是由四个不同的亚基α、β、β′和σ组成，分别由rpoA、rpoB、rpoC和rpoD基因编码。全酶是由核心酶和σ亚基共同构成，核心酶是由两条α链，一条β链和一条β′链4条肽链形成的具有催化能力的酶，σ亚基作为启动子特异地启动转录。

目前，对利福平耐药已经成为结核病治疗方面一个较为严重的问题，并且这些耐药菌很快还会产生对异烟肼的耐药，从而形成耐多药结核分枝杆菌。研究发现结核分枝杆菌耐利福平的发生是由于其编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变所致。rpoB基因含有3534bp的开放阅读框架，编码1178个氨基酸。此基因中少数密码子突变会引起它所编码的氨基酸的改变，使得RNA聚合酶分子上利福平结合位点的构象发生改变，从而丧失了结合利福平的能力导致耐药性的出现。超过95%的突变都是发生在 rpoB基因的一个高度保守的81bp(507~533位27个氨基酸)的核心区域内，主要包括点突变、缺失突变等，因此该区又称为RFP耐药决定区。突变通常发生在531、526和516位密码子，其他突变的密码子还有511、513、514、515等，,但最常见的突变位点是531位丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)，526位组氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)、516位天冬氨酸(Asp)→缬氨酸(Va1)，其中531位是突变率最高的密码子。

现有的结核分枝杆菌利福平耐药性检测所使用的方法，有绝对浓度法、RFLP法和测序法，其中绝对浓度法存在着二次培养，每次八周，周期长及污染机率高；RFLP法由于采用限制性内切酶，而RFP耐药决定区内缺少合适的酶切位点，致rpoB基因突变的检出率仅为10%，不能满足临床诊断的要求；测序法价格昂贵等缺陷。

发明内容

发明人在多年从事医学检测的工作和研究活动中，发现现有的对结核分枝杆菌利福平耐药性检测方法，存在着诸多缺陷，经过不断探索分析，反复大量试验，目的在于提出一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，能够快速、准确、低成本检测出rpoB基因RFP耐药决定区的全部突变，更有效地满足临床诊治的需求。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，该方法采用以下步骤：培养-提取-扩增-纯化-消化-分离-密集-显像-鉴定，其中：

A.培养，采集病人痰液标本于37℃进行一次培养，制备结核分枝杆菌培养物；

B.提取，从上述结核分枝杆菌培养物中提取总DNA；

C.扩增，采用包括新型上、下游引物在内的反应体系进行PCR反应，扩增出258bp DNA基因片段；