[发明专利]一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法

权利要求书

1.一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是该方法采用以下步骤：培养-提取-扩增-纯化-消化-分离-密集-显像-鉴定，其中：

A.培养，采集病人痰液标本于37℃进行一次培养，制备结核分枝杆菌培养物；

B.提取，从上述结核分枝杆菌培养物中提取总DNA；

C.扩增，采用包括新型上、下游引物在内的反应体系进行PCR反应，扩增出258bp DNA基因片段；

D.纯化，对上述PCR反应扩增出的258bpDNA基因片段产物，采用核酸外切酶和DNA片段纯化试剂进行提纯；

E.消化，采用核糖核酸裂解酶对纯化后的258bp DNA基因片段产物进行裂解消化，成为长度不同的多个基因片段；

F.分离，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经消化后的多个基因片段；

G.密集，将分离后的多个基因片段转移到醋酸纤维滤膜上，并加以提纯、浓缩、密集；

H.显像，采用标记地高辛显色系统对密集后的醋酸纤维滤膜进行条带着色显像，得到基因片段图谱；

I.鉴定，以正常型做对照，依据图谱中条带长度、数量、迁移位置及显像强度鉴别确定结核分枝杆菌rpoB突变基因。

2.根据权利要求1所述的一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是在扩增步骤中，

所述反应体系为10×Taq Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 4μl，20mmol/L新型上、下游引物 1μl/pair，DNA模板2.5ul，5u/μl Taq DNA polymerase 0.5ul，加灭菌双蒸水至总体积 50ul；

所述新型上游引物采用地高辛标记序列5' DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3'，新型下游引物采用地高辛标记序列5' DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3；

所述PCR反应的条件，采用94℃预变性5min，然后按93℃ 0.5min变性，采用58℃ 45s退火，72℃ 1min延伸，经35个循环后，最后一次循环72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是在消化步骤中，所述消化的条件采用从30℃以0.1℃/s的速度逐渐上升到80℃对基因片段进行梯度加热以充分消化。