[发明专利]一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法

说明书

技术领域                                        

本发明涉及改造大肠杆菌染色体基因使之作为外源蛋白生产的细胞工厂，确切地说是一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法。

背景技术

重组蛋白药物市场增长迅猛，已成为一个巨大的高新技术产业。其中重要的重组蛋白药物有：细胞因子，蛋白类激素，酶和抗体等。但因这些药物生产成本高，找到高效低成本的生物系统与生产工艺尤为必要。

重组蛋白的生产通常使用微生物系统。微生物系统具有生长快与成本低的优点。大肠杆菌是使用最广泛的微生物系统。在大肠杆菌系统中，根据重组蛋白表达后的空间定位，可分为胞内表达与胞外表达。胞外表达正常情况下为可溶性产物。胞内表达又可分为胞质中表达与周质空间表达，且常形成包涵体。胞外表达与周质空间表达的蛋白较少受到蛋白酶的降解，有利于目标产物的积累。大肠杆菌有多种转运系统将蛋白分泌至周质空间，最常用的是Sec系统。但大肠杆菌缺乏天然的胞外分泌机制，绝大多数外源蛋白无法分泌到胞外。

胞内重组蛋白药物常规生产工艺包括菌株构建、发酵、破壁、蛋白分离与精制。但因胞内杂蛋白成分复杂、易形成无活性的包涵体，因而分离成本高、产率低。特别是胞内表达需要破碎细胞，而导致产品中存在磷脂多醇与蛋白复合物等热原成份，严重影响药品生产。 因此，一种通用、高产、简便和高效而稳定的生产体系亟待建立。

目前，仅少量文献报道了大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法。且多为理化诱变的方法，可以筛选到胞外高产突变株，但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，遗传性改造可使大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌的细胞外膜缺陷，导致周质空间蛋白部分释放到培养基中。使用渗漏菌株进行胞外蛋白的生产鲜有报道。如：大肠杆菌的lpp基因突变体可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中，但目标蛋白的渗漏比率及其产量仍然有提高的空间。

发明内容

本发明提供一种大肠杆菌重组蛋白的发酵和胞外分泌同时进行的重组蛋白生产方法，通过遗传改造的方法得到细胞壁或膜的通透性增强的分泌型菌株，并将胞内合成的目标蛋白质通过信号肽或融合蛋白（如：硫氧还蛋白等）导入到细胞周质空间，进而选择性地渗漏至培养基中，提高表达水平和降低分离成本成为本发明的目的。

一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；

所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建方法为：使用预先设计的细胞膜蛋白或细胞壁合成酶基因pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种单基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10～250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的浓度为1～1000 ng/μl的pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种基因打靶片段，并整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到分泌型大肠杆菌菌株。

所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株含有的基因pal编码区发生了突变，或者基因pal的启动子区域发生了突变，从而使pal基因无法表达出相应的Pal蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。

所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为：将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒中，随后克隆到该分泌型大肠杆菌中，进而得到分泌型重组大肠杆菌菌株。

所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。

所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于：所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。