[发明专利]一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；

所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建方法为：使用预先设计的细胞膜蛋白或细胞壁合成酶基因pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种单基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10～250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的浓度为1～1000 ng/μl的pal或mrcB，mrcA，mrdA，murC，rodA，rodZ中的一种基因打靶片段，并整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到分泌型大肠杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株含有的基因pal编码区发生了突变，或者基因pal的启动子区域发生了突变，从而使pal基因无法表达出相应的Pal蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。

3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为：将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒中，随后克隆到该分泌型大肠杆菌中，进而得到分泌型重组大肠杆菌菌株。

4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于：所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。

5.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于：所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于：所述的发酵培养基中含有：0.1～2%胰蛋白胨，0.2～10%酵母提取粉，0.05～5%甘油，0.02～0.5% KH₂PO₄，0.1～2% K₂HPO₄。