[发明专利]一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于人血清白蛋白重组表达技术领域，涉及一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞。

背景技术

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是血浆中含量最为丰富的蛋白质。它是一种在肝脏中合成的非糖基化球蛋白。在健康人体中的血循含量为42g/l。白蛋白在人体中发挥着重要的作用。它参与了脂肪酸、氨基酸、胆色素以及许多的小分子运输，对维持血液正常的渗透压有着重要的意义。另外，它具有独特的结合内源和外源复合物能力，可以储存循环代谢和作为细胞外的抗氧化剂。因此，人血清白蛋白的应用除了广泛用作血浆容量扩充剂外，它还可以作为药物赋形剂、稳定剂和药物载体等。

目前，大多数治疗性的HSA都是从人血浆或全血中通过乙醇分馏纯化而来。尽管这种纯化而来的HSA是较安全的，但是一方面，血浆的供应和纯化也会受到一些病毒的污染，例如，艾滋病病毒（HIV），肝炎病毒C和朊病毒，等。另外，血源供应毕竟是有限的。因此，重组人血清白蛋白（rHSA）的生产研究对开发人血清白蛋白替代品有着重要的意义。

利用乳腺生物反应器生产药用蛋白早在90年代已兴起，乳腺生物反应器是将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白。采用乳腺生物反应器生产药用蛋白质是一种全新的生产模式，它已经成为生物技术领域发展的重要方向。而应用体细胞核移植技术（SCNT）生产乳腺生物反应器，不仅可以在体外培养条件下对整合外源基因的体细胞进行大量增殖和筛选，还可以对外源基因的整合和表达进行初步分析，后将通过以上筛选和分析得到的阳性克隆体细胞进行核移植，得到具有同一遗传特征的转基因动物群系。另外，该技术突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本（WHEELER MB,WALTERS EM.Transgenic technology and applications in swine[J].Theriogenology，2001,56:1345-69）。

SCNT在生产乳腺生物反应器的应用已表现出强大的生命力。早在1987年，Gordon等就首次报道了人的组织纤溶酶原激活剂(tPA)基因在小鼠的乳腺中成功表达（Gordon K,et al.Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk[J].Nature Biotechnology，1987,(5):1183-1187）。1991年，Wright G等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的轰动（Wright G;Carver A,Cottom D.High level expression of active human Alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep[J].Nature Biotechnology，1991,9:830-834）。2002年，Van Berkel等成功获得了人乳铁蛋白转基因牛，乳汁中人乳铁蛋白的含量上升到3g/L（Van Berkl et al.Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows[J].Nature Biotechnology，2002,20:484-487）。2006年，Maga等将人溶菌酶基因在转基因山羊乳腺中的表达量提高到270μg/mL（Maga E A et al.Consumption of milk from transgenic goat expression human lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinal microfluro[J].Transgenic Ras,2006,15:515-519）。2008年，邹贤刚等利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ（rhATⅢ）蛋白，其中1头转基因克隆羊后代的奶中rhATⅢ的含量为3g/L（邹贤刚,袁三平,鲜建，等.转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白质(rhATⅢ)[J].生物工程学报,2008,24(1):117-123）。2009年，Yann等人成功地将人血清白蛋白在转基因牛乳腺中表达，其最高表达量可达40g/l（Yann Echelard et al.Production of recombinant albumin by a herd of cloned transgenic cattle[J].Transgenic Res 2009,18:361-376）。