[发明专利]一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞

权利要求书

1.一种HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，包括位于启动子下游的目的基因HSA，在HSA基因的5'端连接BCP5序列，在其3'端连接有BGHpolyA序列；在启动子的上游还设有phiC31整合酶特异性识别位点。

2.如权利要求1所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的目的基因HAS包括了HSA所有外显子和前6个内含子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；BCP5序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；BGHpolyA序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.如权利要求1所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，还包括抗生素筛选基因和标记基因，标记基因位于启动子与BCP5序列之间，抗生素筛选基因位于BGHpolyA序列和phiC31整合酶特异性识别位点之间；抗生素筛选基因的上下游还分别设有两个同向的loxP序列。

4.如权利要求3所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因为neo基因，标记基因为EGFP基因；phiC31整合酶特异性识别位点为attB，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；loxP序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

5.如权利要求3所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的标记基因与BCP5序列之间还设有两个串联的c HS4绝缘子序列，BGHpolyA序列和抗生素筛选基因上游的loxP序列之间还设有一个c HS4绝缘子序列；所述的c HS4绝缘子序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

6.如权利要求1～5任何一项所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，该载体是pIACH表达载体，包括以下依次连接的元件：PUC ori、attB序列、CMV启动子、EGFP标记基因、两个串联的c HS4绝缘子序列、BCP5序列、HAS基因、BGHpolyA序列、一个c HS4绝缘子序列、lxop1序列、SV40p、SV40ori、抗生素筛选基因neo、HSV TKpolyA和lxop2序列。

7.一种基于权利要求6所述的HSA乳腺特异性载体的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为原代牛乳腺上皮细胞，通过HD转染试剂将外源性表达载体p IACH和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染到宿主细胞中。

8.一种诱导权利要求7所述的重组细胞HAS表达的方法，其特征在于，将pIACH阳性表达的牛乳腺上皮细胞在无血清M199培养液中培养，添加5～10ng/ml的上皮生长因子（EGF），5～10μg/ml绵羊催乳素，1～5%体积分数胰岛素样的转铁蛋白进行诱导，每24小时更换一次培养液，诱导时间为15～20天。

9.一种包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过HD转染试剂将外源性表达载体p IACH和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染到宿主细胞中。

10.权利要求9所述的包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。