[发明专利]一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法，属于微生物快速诊断领域。

背景技术

类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌，曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科，邻单胞菌属。

淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地，鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加，是人类肠胃炎的主要病因之一，世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染，该菌亦与旅行者腹泻密切相关。来自日本的一项研究发现在1994至1996年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中，类志贺邻单胞菌位居第一(66.7％)。由类志贺邻单胞菌引起的死亡率也在逐渐增高。一些类志贺邻单胞菌的感染者由于未能快速准确的诊断和合理的应用抗生素，而没有得到及时的治疗而产生了严重的后果，甚至死亡。

虽然类志贺邻单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明，但研究者已经对一些潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关，人体中的亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源，并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系统，hugA基因是编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一，并且编码外膜蛋白受体，是影响类志贺邻单胞菌毒力的一个重要基因，因此也是一个理想的检测目的基因。

目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有分离培养、生化鉴定，普通PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要3-5天完成，不能满足快速检测的需求。并且该菌缺少特异的筛选培养基，在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似，难以区别，这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。最近几年，PCR和实时荧光PCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广，但这些方法的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。类志贺邻单胞菌做为一种新发的传染性疾病对流行病学家和临床医生造成的最大困难就是缺少能够对其进行早期、快速、准确检测的方法，以满足农村地区和基层实验室的实际工作需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法。LAMP是针对靶序列的6个特异部位设计4条引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条引物之中2条为内引物，即FIP(ForWard inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)。FTP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。外引物为F3和B3。