[发明专利]皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因组DNA的提取方法，特别是一种皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法。

背景技术

皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai) 属于软体动物门腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目，是鲍科贝类分布于我国北方的唯一种，也是辽宁和山东沿海海水养殖的重要对象。利用现代分子生物学技术，对皱纹盘鲍进行群体遗传结构分析和遗传改良等操作，均必须对皱纹盘鲍的基因组DNA进行提取。传统的动物基因组提取方法主要是以肌肉组织或外周血细胞为DNA提取对象，这些方法都会不可避免地导致皱纹盘鲍处于应激状态，造成永久性损伤甚至死亡，无法使试验对象继续应用于生产。目前，国际贝类育种已开始流行基于亲权鉴定的Walk-back选择法，而采用此种方法必须在选择前对子代贝类的家系归属进行鉴定，因此现在需要采用一种无损伤的DNA提取方法，以免影响鲍的存活能力和生产性能。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种简单、高效、便捷，且不会对皱纹盘鲍造成损伤，不影响其存活能力和生产性能的皱纹盘鲍基因组DNA无损伤提取方法。

本发明的技术解决方案是：一种皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，其特征在于包括以下步骤：

a、使用沾有70%-75%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置，待分泌粘液后，刮取0.1-0.2g粘液和表皮组织碎片的混合物，将该混合物中加入无水乙醇固定，冰上静置5-10分钟后，离心分离，取沉淀；

b、所得沉淀中加入细胞裂解液，震荡混匀；

c、在上步中获得的混合样品中加入6μl-20μl，5mg/ml-10mg/ml的蛋白酶K，在65℃的条件下消化3-5小时，且每15分钟震荡一次，消化完成后在4℃条件下冷却10-20分钟；

d、在冷却后的样品中加入7.5M/L的NH₄Ac，加入的体积为样品总体积的                                                ，冰上静置5-10分钟后，4℃条件下离心，取上清液；

e、在所得的上清液中加入与其体积相同的异丙醇，充分震荡混匀，冰上静置2-5分钟后，离心取沉淀；

f、所得沉淀用70%-75%的乙醇洗涤两次，室温下晒置5-10分钟，获得皱纹盘鲍基因组DNA。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明与传统的动物基因组DNA提取方法的主要区别是，通过75%的乙醇刺激皱纹盘鲍的外套膜，使其分泌粘液，并通过处理粘液即挂取粘液时一同获得的表皮组织碎片进而提取基因组DNA。本方法的优点是：首先，保护了取样个体的组织完整性，没有造成任何机械性损伤，通过不长的恢复期个体即可从应激状态中恢复过来，可以长期多次取样；其次，通过75%乙醇清洗，起到了消毒杀菌和减少外源DNA干扰的作用，有利于获得高质量的DNA。本方法所得DNA可广泛应用于皱纹盘鲍的种群遗传结构分析、系统进化和分子标记辅助育种等方面，也为利用分子手段连续监测特定个体的生长发育情况奠定了基础。同时本方法还可以应用于其它贝类如九孔鲍、栉孔扇贝等的育种上。因此可以说这种DNA提取方法具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场和科研前景十分广阔。

具体实施方式

下面说明本发明的具体实施方式。

实施例一

皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，它包括以下步骤：首先取鲜活皱纹盘鲍，用无菌人工海水反复冲洗3遍，使其腹面朝上，室温下静置5分钟。使用沾有70%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置5分钟，待分泌粘液后，刮取0.1g粘液和表皮组织碎片的混合物，并将混合物放入离心管内，向离心管中加入600微升无水乙醇进行样品固定，固定后的样品于冰上静置8分钟后，上离心机分离，取沉淀物；

在所得的沉淀物中加入细胞裂解液600微升，这里的细胞裂解液推荐选用Tris-Cl 100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震荡混匀；

混匀后的样品中加入6μl的蛋白酶K（其浓度为10mg/ml），并在65℃条件下消化3小时，每15分钟震荡一次，消化完成后在4℃条件下冷却10分钟；

在冷却后的样品中加入7.5M/L的NH₄Ac，加入的体积为样品总体积的三分之一，在冰上静置5分钟后，4℃条件下离心，取上清液；