[发明专利]一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和组织工程技术领域。本发明涉及一种蛋白质芯片，尤其涉及一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法。

背景技术

蛋白质不仅是生命的重要构成部分，其功能以及其与生物分子的相互作用更是形成生命的关键一环。蛋白质阵列芯片是研究蛋白质（包括蛋白质分子之间，蛋白质分子和核酸及其其他小分子之间的相互作用）的重要方法和手段，其具有高通量的特性。目前蛋白质芯片的发展处于发展的瓶颈期，究其原因如下所分析。

传统的蛋白质芯片主要制备方法是，通过将纯化好的目标蛋白以特定的方式固定在固相基底上制备而成。这个方法是目前蛋白质阵列芯片最主要的制备手段，然而其大范围应用存在诸多尚未解决的问题：（1）蛋白质表达、纯化是蛋白质研究领域的一个重大难题，高通量化纯化蛋白质是一项耗费人力物力的巨大工程；（2）蛋白质是一个具有三级或者四级结构的生物分子，在分离纯化过程中容易造成蛋白质的失活，如何保持蛋白质的活性尚未有有效解决手段；（3）蛋白质容易受外界条件（温度，湿度以及盐浓度等）影响而失活，因此蛋白的存储问题也是亟需解决的问题；（4）纯化获得的蛋白质在基底上固定后，能否保持其原有的生物学活性也是阻碍传统蛋白质芯片技术发展的重要因素。针对传统蛋白质芯片制备的这几项难题，为解决蛋白质来源及其在基底固定等问题，国内外多个研究小组，利用无细胞表达技术，通过将基因芯片直接转化为蛋白质芯片的方法，制备出了蛋白质原位表达阵列（In Situ Protein Array），即蛋白质原位芯片（Joshua LaBaer et aL.,2005;Deb K Chatterjee et aL.,2006;Mingyue He et aL.,2008;Mingyue He et aL.,2009;Mingyue He et aL.,2009;Mingyue He et aL.,2008）。其通用原理为：在芯片表面固定含有目标蛋白质基因的遗传物质，通过无细胞蛋白质表达体系进行转录和翻译联合合成蛋白质，最后表达出的蛋白质在原位经过抗体等捕获物得到固定从而形成蛋白质阵列芯片。原位构建蛋白质阵列的方法到目前为止主要有蛋白质原位阵列技术(PISA,Protein In Situ Array)(Mingyue He et aL.,2001)、多重点样技术（MIST,MuLtipLe Spotting Technique）(DoLores J.CahiLL et aL.,2003)、核酸编程性蛋白质阵列技术（NAPPA,NucLeic Acid ProgrammabLe Protein Array）(Joshua LaBaer et aL.,2004)等技术。不同的原位表达芯片的构建的基于的原理大同小异，其优点是：（1）避免了由于分离纯化储存造成的蛋白质失活，并且可以表达在细胞内难以表达的毒素蛋白、膜蛋白以及真核细胞特有的转录后修饰蛋白。（2）针对蛋白质在基底表面的捕获问题，构建能够表达含有各种蛋白质标签（包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段以及识别生物素链霉素的肽段）的核酸模板，相应地在衬底表面孵育上捕获相应标签的捕获抗体或者其余捕获分子（anti-His，anti-GST,anti-FLag等，可以是一个或者一个以上），从而利用原位捕获的方法克服了传统蛋白质芯片中蛋白质固定的缺点。然而根据上述方法构建的蛋白质原位芯片还存在一定的缺点：（1）检测方法比较单一，基本都是基于荧光检测而构建的，因此无法实时监测蛋白质相互作用的动力学过程；（2）这些方法构建的蛋白质原位芯片都不能进行有效的重生，反复利用。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术中的蛋白原位表达芯片检测方法单一、不能重复利用的不足，提供一种蛋白质原位表达芯片及其制备方法和应用，该芯片能够重复利用，并且不仅能用于传统的荧光检测，更重要的是还能用于生物传感器进行实时相互作用的动力学过程的监测。

针对上述技术目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种蛋白质原位表达芯片，所述芯片包括固定有捕获载体的基底和粘合在基底上的流通池，所述基底上分布有至少一个与表达捕获载体相结合的蛋白质，所述蛋白质通过在芯片上原位表达，并干燥后获得；所述流通池的两端分别设有流通池入口和流通池出口，优选地，通过洗耳球或压缩空气干燥，更优选地，所述基底由金片制成。

优选地，所述蛋白质通过点样仪将用于表达与捕获载体相结合的蛋白质的核酸分子分布于基底上，再无细胞表达裂解液通入流通池中进行原位表达，获得与捕获载体相结合的蛋白质。