[发明专利]一种基因工程细胞及其在NK细胞扩增中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及疾病免疫治疗，尤其涉及NK细胞免疫治疗中NK细胞的体外制备。

背景技术

NK细胞（natural killer cell，自然杀伤细胞）是一类大颗粒淋巴细胞，是机体固有免疫和适应性免疫的重要桥梁，在机体抗感染性疾病和恶性肿瘤免疫监视过程中发挥重要作用。继发性NK细胞移植能产生良好的抗肿瘤效应，而其自身很少被受体排斥，且不会引起任何GVHD（Graft Versus Host Disease）。因此，继发性NK细胞治疗（Adoptive NK cell therapy）已成为目前最热门和最有前途的恶性肿瘤治疗方法之一。

尽管继发性NK细胞免疫治疗具有良好的抗肿瘤效应和巨大的应用前景，但NK细胞免疫治疗仍然难以进行常规临床应用，其中最主要障碍在于，在外周血单核细胞（PBMC）中，NK细胞只是一个很小的群体，仅占人外周血单核细胞的10～15%，难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要在数量上保证NK细胞的有效供给。因此，探索各种有效的NK细胞体外扩增（Ex vivo expansion）方法已成为NK细胞免疫治疗的必然趋势。

应用基因工程细胞（ Gene engineering cells, GEC）作为饲养细胞（feeder cell）进行NK细胞体外扩增是一种重要的NK细胞扩增新策略。在以往的研究中有研究者应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞(Antigen present cell, aAPC)，然后将4-1BBL（CD137L）和膜固定IL15（membrane-bound IL-15, mIL-15）等导入此细胞中，构建CD64-CD86-4-1BBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。本发明中，我们通过基因工程技术将4-1BBL和膜固定IL21（mbIL-21）直接修饰到K562细胞表面，构建4-1BBL-mbIL-21-GEC。与以往的人工抗原递呈细胞相比，本发明更加简单和易于操作。研究表明，4-1BBL-mbIL-21-GEC可以诱导产生大规模功能性的NK细胞，在NK细胞免疫治疗临床应用和科学研究中具有重大应用价值。

发明内容

本发明的目的是，提供一种基因工程细胞。

本发明的第二个目的是，提供一种基因工程细胞的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供一种基因工程细胞在NK细胞扩增中的应用。

本发明的第四个目的是，提供一种NK细胞扩增方法。

为了解决本发明第一个目的，本发明提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为4-1BBL-mbIL-21-GEC，其细胞膜表面稳定表达4-1BB配体和膜固定白介素21（mbIL-21）。

作为一个优选，所述基因工程细胞为4-1BBL-mbIL-21-K562细胞。

为了解决本发明第二个目的，本发明提供了基因工程细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建4-1BBL表达的转座子；

（2）4-1BBL转座子与转座酶SB11共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞4-1BBL-GEC；

（3）在步骤（2）获得的4-1BBL-GEC 基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21（membrane-bound IL-21, mbIL-21），建立4-1BBL-mbIL-21 -GEC。

作为一个优选，所述基因工程细胞为4-1BBL-mbIL-21-K562细胞。

为了解决本发明第三个目的，本发明提供了基因工程细胞在NK细胞扩增中的应用。

为了解决本发明第四个目的，本发明提供了一种NK细胞扩增方法，利用上述基因工程细胞进行扩增，包括以下步骤：

（1）构建4-1BBL表达的转座子；

（2）4-1BBL转座子与转座酶SB11共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞4-1BBL-GEC；

（3）在步骤（2）获得的4-1BBL-GEC 基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21（mbIL-21），建立4-1BBL-mbIL-21 -GEC；

（4）致死性照射或丝裂霉素处理步骤（3）获得的基因工程细胞，按2: 1与外周血单核细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；

（5）每周重复刺激1次，连续数周，以获得足够量的NK细胞。