[发明专利]一种预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的设计及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的疫苗及其构建方法，尤其是涉及FnBPA分子为靶标的DNA疫苗及其构建方法。更具体地说，本发明涉及抗奶牛乳腺炎的核酸疫苗和编码该疫苗的粘附素分子的特定核苷酸序列，抗原表位和表达方式。 

背景技术

由金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎在世界范围内都造成了巨大的损失。截止2011年我国奶牛存栏头数1300万头，每年由乳腺炎造成的经济损失可达40亿元。近些年来，抗生素的大量使用甚至滥用，使金黄色葡菌球菌的抗菌谱逐渐扩大，给临床治疗和预防金黄色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑战。目前认为疫苗是防控金黄色葡菌球菌感染的有效方法。 

迄今金黄色葡萄球菌疫苗研制经历了全菌灭活苗、亚单位疫苗和DNA疫苗3次重大变革。1902年，Wright将体外培养的金黄色葡萄球菌全菌灭活，制成灭活苗免疫牛，结果免疫效果不理想，不能有效抵抗新的感染发生(赫娜，杨宏军，王长法等.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗研究进展.动物医学进展，2009，30(1)：93-96.)林峰强等(林峰强，胡松华，胡奇林等.奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗佐剂研究现状.动物医学进展，2004，25(6)：49-51.)针对灭活苗的不足研制出了针对金黄色葡萄球菌单一成分的亚单位疫苗。目前，部分亚单位疫苗已应用于生产中，如在美国获准使用的Soma-to-Staph和Lysigin 2种金黄色葡萄球菌疫苗及大肠杆菌J5菌苗均是基因工程亚单位疫苗。目前，在奶牛乳腺炎疫苗的研制方面，国内起步较晚。 

金黄色葡萄球菌黏附素纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)是细菌感染的先决条件(周宏，李韩平.金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展.生物技术通讯，2004，15(1)：73-75.)，抑制其活性后可从根源上切断金黄色葡萄球菌感染的途径。几乎所有的金黄色葡萄球菌都拥有FnbpA基因，都可以表达纤连蛋白结合蛋白A，此蛋白由于具有与宿主组织的特异黏附能力，正成为抗金黄色葡萄球菌感染疫苗开发的热点分子。 

国内研制的FnBPA重组蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫组小鼠血清中即可检测到抗体，而且随着免疫时间的延长，抗体效价呈明显的上升趋势，在21d达到最高水平，之后抗体水平逐渐降低。通过对小鼠的免疫攻毒试验可知，FnBPA基因工程亚单位疫苗可有效提高小鼠的抗体 水平，免疫保护指数PI达80％，说明疫苗对金黄色葡萄球菌具有较强的免疫保护力。(张海燕，杨宏军，王长法等.重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制.西北农林科技大学学报.2011，5(39)：39-43.)。虽然基因工程亚单位疫苗具有抗原剂量大、纯度高且无遗传物质及宿主和培养基的成分等优点(张延龄，张晖.疫苗学.北京：科学出版社2004：345-377，421-504.)。此外基因工程亚单位疫苗诱导大动物的免疫应答持续时间短，且大动物的免疫成本高。 

为克服这些缺点，我们选择了针对FnBPA的核酸疫苗。核酸疫苗又称基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到质粒或病毒载体上，用重组质粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活体内以天然蛋白的形式呈递抗原，激活机体免疫系统，并能持续的引发免疫反应。其无毒性返祖现象，对病毒变异株也起作用。因此DNA疫苗是近年来备受人们关注的一种新型疫苗。 

Nour等研制了CTLA4和ClfA的重组核酸疫苗并采用了共聚物阳离子包装先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3个月后再用200μg的ClfA重组蛋白加强免疫一次，免疫牛产生了较强的体液免疫及细胞免疫反应(Adel NM Nour Eldin，Lulzim Shkreta，Br Ian G Talbot，et a.l DNA imunization of dairy cows with the clumping factor A of Staphylococcus aureus.Vaccine，2006，24：1997-2006.)。国外已有基于FnBP的黏附机制来研制金黄色葡萄球菌DNA疫苗的报道。目前FnBP分子结构中的D区被称作配体结合区，被认为是主要的免疫优势表位，在目前研制的金黄色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。