[发明专利]一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列及其高效表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列及其高效表达方法。

背景技术

碱性高温木聚糖酶在造纸和纸浆工业中有着无与伦比的作用。随着社会的发展，国家对企业要求越来越高，节能减排成为企业的热门话题。木聚糖酶在造纸和纸浆工业中的重要性在于其取代了有毒的化学物质，同时通过酶法预处理可以回收该行业中有用的副产物，相比化学处理法，本聚糖酶的预处理可以降低漂白过程中化学药品使用量，并且改善漂白效果等优点。因而木聚糖酶在纸浆的漂白中有着极佳的应用前景，也是未来造纸工业的主要发展方向。

但是，在纸浆漂白的过程中所需要的高温碱性木聚糖酶，一般来源于芽孢杆菌和大肠杆菌，它们在原核细胞中可以大量表达，可若想得到大量较纯净的木聚糖酶，就必须进行一系列复杂的纯化过程。为了便于纯化，人们开始采用以毕赤酵母为表达菌株，毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要成份，然而由于来源基因密码子偏好的问题，使碱性木聚糖酶的产量偏低。

前期研究中，张桂敏等人将短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因xynHB(Bacillus sp.HBP8，GenBank登录号：AY954630)通过Dpn I介导的定点诱变，使第639和640位核苷酸AA突变成GC，使得214位氨基酸N变成A(专利公开号CN：1924002A)，使该木聚糖酶的热稳定性显著提高，在60℃的半衰期由12分钟提高到65分钟。在此基础上，本发明将定点诱变过的xynHB基因做进一步优化。

因此，选择合适的表达宿主，使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性，极大的降低碱性木聚糖酶的生产成本，增加企业对其的利用率成为了我们的研究主题。

发明内容

本发明的目的是：

1、本发明提供并公开了一种不含有Sal I、Cpo I等限制性酶切位点，适合在毕赤酵母表达的碱性木聚糖酶基因xynHBs的优化基因序列及其基因制备优化方法。2、本发明还提出了上述xynHBs核苷酸优化序列的高表达方法。

本发明目的之一的步骤为：

(1)优化。采用常规的PCR重叠引物延伸法，将定点诱变过的xynHB基因序列(Bacillus sp.HBP8，GenBank登录号：AY954630)输入DNAworks软件，在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P.pastoris，得到相关的xynHB在毕赤酵母中表达的一系列优化基因序列及引物序列。

(2)改造引物。为了便于蛋白的表达，在引物1的5′添加了碱基序列GTCA，引物22的5′端添加了碱基序列GGCCA。

(3)PCR扩增。以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物22浓度为40nmol/L，依次递减，但中间引物11、引物12浓度最低为0.625nmol/L。具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，30个循环，再72℃延伸10min。

(4)检测。PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化和T载体连接转化，挑选转化子经过测序验证后得到和设计结果一致的xynHBs优化序列。

(5)比较。优化后的xynHBs序列与原始序列xynHB相比，序列中的15％-25％的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，为了避免DNA序列中形成的二级结构对表达的影响，xynHBs基因序列除去了编码产物自身的26个氨基酸的信号肽序列。其中优化后的xynHBs序列与原始序列xynHB相比，效果最好的是序列中的139个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。

本发明目的之二的步骤为：

(1)用本发明目的一中得到的xynHBs优化序列经T₄ DNA聚合酶和dTTP处理后，与经过Cpo I和Not I处理的表达载体pHBM905A连接，构建重组质粒xynHBs-905A。

(2)将重组质粒xynHBs-905A经Sal I线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株GS115/xynHBs-905A。

(3)将阳性重组菌株接种于25ml的BMGY培养基中，28℃，200rpm培养48h，至OD₅₄₀为10-20；