[发明专利]一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列及其高效表达方法

权利要求书

1.一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列，其特征在于优化后的xynHBs序列与原始序列xynHB相比，序列中139个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码均被高频或次高频密码所替换，序列中除去了26个氨基酸的信号肽编码序列，经T₄DNA聚合酶与dTTP处理后，序列的5'端形成了与Cpo I酶切位点相同的粘性末端、3'端形成了与Not I酶切位点相同的粘性末端。

2.一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列方法，其特征在于优化步骤为：

（1）优化，采用实验室常规的PCR重叠引物延伸法，将定点诱变过的xynHB基因序列输入DNAworks软件，在密码子频率表中（Codon Frequency Table）选择P. pastoris，得到相关的xynHBs在毕赤酵母中表达的优化基因序列xynHBs及引物序列；

（2）改造引物，为了便于蛋白的表达，在引物1的5'添加了碱基序列GTCA，引物22的5'端添加了碱基序列GGCCA；

（3）PCR扩增，以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物22浓度为40nmol/L，依次递减，但中间引物11、引物12浓度最低为0.625nmol/L；具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃ 30s，60℃ 30s， 72℃ 90s，30个循环，再72℃延伸10min；

（4）检测，PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物和T载体连接转化，挑选转化子测序后得到和设计结果一致的xynHBs优化序列。

3.根据权利要求1、2或3所述的一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列，其特征在于所述重组载体为将碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列插入出发载体pHBM905A，或载体pPIC9k、或载体pPICZa的克隆位点得到的重组表达质粒；所述重组菌株是上述重组表达质粒转化毕赤酵母GS115得到的。

4.一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列的高效表达方法，其特征在于步骤为：

（1）用权利要求1或2所述的碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列经PCR合成，再经过T₄ DNA聚合酶和dTTP处理后，与经过Cpo I和Not I处理的表达载体pHBM905A连接，构建重组质粒xynHBs-905A；

（2）将重组质粒xynHBs-905A经Sal I线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株GS115/xynHBs-905A；

（3）将阳性重组菌株接种于25ml的BMGY培养基中，28℃，200rpm培养48h，至OD₅₄₀为10-20；

（4）将培养好的菌液5000rpm离心5分钟，去掉上清，转接于25ml的BMMY培养基中，25℃，200rpm培养84h，期间每隔12 h补加甲醇至终浓度1%进行诱导；

（5）温度4℃，5000rpm离心10min收集上清，上清液中含有大量的活性碱性木聚糖酶。