[发明专利]一种制备来匹卢定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备来匹卢定的方法。

背景技术

1884年Haycraft首先发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质，直至1957年Markwardt才把这种从医用水蛭中分离出来的抗凝物质纯品命名为水蛭素。水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。

动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭素会有较好的效果。

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

但是，天然水蛭素来源非常困难，每条水蛭只含有20ug的水蛭素，不能满足临床应用，为此国外多家公司及研究单位从上世纪80年代就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素，他们根据天然水蛭素的化学结构，利用基因工程技术开发出的重组水蛭素药物已上市（Lepirudin、Desirudin）。但是利用基因工程技术开发的重组水蛭素药物由于由于极易丢失短肽，准确性不高。

来匹卢定(Lepirudin)是由65个氨基酸，三对二硫键形成的多肽产品，和天然水蛭素相比，来匹卢定63位酪氨酸残基未硫酸化，这就使得来匹卢定对凝血酶的抑制常数比天然水蛭素降低了90％。但由于心脑血管疾病的巨大市场需求，来匹卢定在国际上仍然具有广泛的应用前景。

目前主要采用逐步偶联法制备备来匹卢定，但是制备周期长，耗能高，纯度仅为20～30%左右，并且主峰旁有许多的杂峰，导致进一步纯化难度较大，且制得的来匹卢定的总收率仅为3～4%，收率较低。因此，提供一种制备来匹卢定的方法具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种制备来匹卢定的方法。该方法采用了逐步合成及片段合成相结合的方法，大大降低了合成的难度，节约了合成的时间，并减少了最终的杂质，提高了纯度和收率，具有可观的经济实用价值，同时在多对二硫键成环类多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种制备来匹卢定的方法，包括如下步骤：

步骤1：取甘氨酸与CTC树脂偶联获得甘氨酸-CTC树脂；

步骤2：取甘氨酸-CTC树脂采用逐步偶联法分别获得片段-CTC树脂；

取片段-CTC树脂分别经第一裂解得到相应的片段；

步骤3：取谷氨酸与RinkAmide树脂偶联获得谷氨酸-RinkAmide树脂；

步骤4：取谷氨酸-RinkAmide树脂采用逐步偶联法获得片段-RinkAmide树脂；

步骤5：取片段-RinkAmide树脂采用片段偶联法将步骤2相应的片段依次偶联，获得Lepirudin-RinkAmide树脂；

步骤6：取Lepirudin-RinkAmide树脂经第二裂解获得Lepirudin线性粗肽，再经液相氧化、纯化、冻干，即得。

作为优选，步骤2中第一裂解的裂解液为TFE溶液，TFE溶液中TFE与DCM的体积比为8:2。

作为优选，步骤2中第一裂解的裂解时间为1～5h。

作为优选，步骤6中第二裂解的裂解液中TFA、EDT、PhsMe、PhoMe、Tis与水的体积比为85～90：1～4：1～3：1～3：1～3：0～2。

作为优选，步骤6中第二裂解的裂解时间为2～8h。

作为优选，步骤6中液相氧化采用谷胱甘肽体系，pH值为7～9。