[发明专利]一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法及试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。根据致病力强弱，HPV被分为高危型和低危型两种，“是否能致癌”是危险度大小的主要标志。全世界每年宫颈癌的新发病例大约有500,000，是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。HPV和宫颈癌的病因学关系已经明确，从HPV感染到宫颈癌发生需要较长时间，在此期间通过检测可以了解是否感染HPV，早发现早治疗，从而有效预防宫颈癌的发生。

目前主要的技术方法如下：1.原位杂交：优点是特异性好；缺点是操作繁琐费时耗力、需要大量较纯的DNA。2.DNA直接捕捉法：优点是有大量的数据支持该技术的应用，能检测高危型别；缺点是灵敏度低于PCR；不能确定具体的HPV亚型。3.亚型特异性PCR：优点是特异性较好；缺点是劳动强度大。4.通用引物PCR：优点是灵敏度高，一次可以扩增多种亚型；缺点是不能区分确定具体HPV的亚型。5.PCR产物直接测序：优点是在确定目前尚未知道的HPV亚型感染以及突变研究时尤其有用；缺点是不是十分灵敏，特别是对HPV混合感染的临床样本更是如此，不宜作为体外诊断方法。6.PCR-酶联免疫分析法：优点是灵敏度高；缺点是样本消耗大。7.PCR-固相反向杂交法：优点是效率高、一次实验可分出多个HPV亚型；缺点是重复性较差。8.荧光定量PCR：优点是灵敏度高、操作方便、耗时短；缺点是通量少、一次只能检测1-2个亚型、且不能确切分型。9.优点是成本相对较低，操作简单；缺点是可以观察到细胞形态的变化，但不能确定发生细胞形态变化的病因；取样的部位决定检测的结果。

综上，目前的人乳头瘤病毒(HPV)的主要检测方法存在操作繁琐费时耗力、灵敏度低、劳动强度大、样本消耗大、重复性较差、通量少的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)的分型定量检测方法，包括如下步骤：(1)收集宫颈样品；(2)样品DNA提取；(3)以提取的DNA样品为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。

优选地，所述步骤(2)包括如下子步骤：

1)取500μL细胞保存液于1.5mL EP管中，13000g离心5分钟，去掉上清液，底部为宫颈脱落细胞；

2)向含有宫颈脱落细胞的EP管中加入500μL裂解液，裂解10分钟；

3)向裂解液中加入100μL磁珠吸附游离的DNA；

4)用清洗液将磁珠清洗两次；

5)100μL洗脱液洗脱DNA。

优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。

优选地，所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为94℃、60℃、70℃、4℃。

优选地，所述步骤(4)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。

本发明的另一方面涉及一种用于上述方法的试剂盒，包括以下试剂：引物管、溶液X、PCR缓冲剂、25mM氯化镁、聚合酶以及阳性对照。

本发明的有益效果为：

1.灵敏度高、重复性好：采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。

2.准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。

3.高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测19种呼吸道病毒，22个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。

4.精确定量：可精确定量病原体基因拷贝数。

5.灵活性强：可随时根据需求增加或删减HPV亚型。

6.成本低：利于大规模推广。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。