[发明专利]一种改善奶牛的抗乳腺炎能力的实现方法及其应用

权利要求书

1.一种改善奶牛的抗乳腺炎能力的选种方法，其特征在于通过实时荧光定量RT-qPCR和同位素标记相对和绝对定量iTRAQ的方法提供一个奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候选基因；通过反转录RT-PCR和克隆测序分析可变剪切，同时通过基因直接测序技术检测到该基因的单核苷酸多态性SNPs，利用软件分析可变剪切和SNPs的关系，同时对体细胞评分SCS和A2M基因型进行关联分析，判断SNPs位点为功能性位点，选择有利的等位基因型个体作为奶牛抗乳腺炎能力留种。

2.一种改善奶牛的抗乳腺炎能力的选种方法，其特征在于其步骤是：

a：筛选A2M基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因，a1：对A2M mRNA进行荧光定量PCR，记录结果，a2：利用同位素标记相对和绝对定量iTRAQ的方法对A2M蛋白进行相对定量，记录结果；

b：利用反转录RT-PCR扩增产物电泳及克隆测序分析可变剪切；

c：A2M基因的功能性SNP位点鉴别；

d：SNPs和可变剪切关系的分析。

3.根据权利要求2所述的一种改善奶牛的抗乳腺炎能力的选种方法，其特征在于a：筛选A2M基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因，

a1：对A2M mRNA进行荧光定量PCR步骤是：

首先分别选择3头正常的和3头患乳腺炎的乳腺组织，利用PremixEx TaqTM II(大连宝生物工程公司，中国)和480 II(Roche Diagnostics)仪器进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相对表达水平用持家基因β-actin(序列号：NM_173979.3)做内参，实验重复三次；

20μl RT-qPCR扩增体系：10.0μlPremix Ex TaqTM II(2×)，0.4μM上下游引物：

A2M-F：SEQ ID NO.1，A2M-R：SEQ ID NO.2；

或

β-actinF：SEQ ID NO.3，β-actin-R：SEQ ID NO.4；

2.0μl A2M cDNA(＜100ng)

或

β-actin质粒DNA，6.4μl蒸馏水；

扩增反应条件：94℃5min；然后94℃15s，56℃15s，这一步共40个循环；最后70℃5s，

分析荧光定量的结果，比较A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量和正常的乳腺组织中的表达量；

a2：利用同位素标记相对和绝对定量iTRAQ的方法对A2M蛋白进行相对定量步骤是：

利用同位素标记相对和绝对定量iTRAQ的方法对3头正常的和3头患乳腺炎的乳腺组织A2M蛋白进行相对定量，牛的蛋白参考数据库为UniProt ID：Q9H0H5，iTRAQ的结果比较患乳腺炎组织A2M蛋白表达量和正常的组织表达量；

b：利用反转录RT-PCR扩增产物电泳及克隆测序分析可变剪切的步骤是：

以奶牛乳腺组织提取的cDNA为模板，根据A2M基因cDNA序列(NCBI参考序列：NM_001109795.1)设计特异引物扩增A2M cDNA片段，特异引物上游引物A2MF序列为：SEQ ID NO.9，下游引物A2MR序列为：SEQ IDNO.10，

25μl PCR体系反应成分包括：DNA(100ng/μl)1μl，A2MF，A2MR引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix(北京诺维森生物公司)12.5μl，重馏水补至25μl，

PCR程序为：94℃4min，然后94℃30s，64.9℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃10min，

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，结果发现除了4623bp PCR目的带外，还有4条清晰的带，对这4条带纯化后连接到载体，测序后发现2种新的可变剪切形式，标记为A2M-AS1和A2M-AS2；

c：A2M基因的功能性SNP位点鉴别步骤是：

根据引起基因可变剪切机制的相关背景资料，参考NCBI中牛A2M基因序列(序列号：NC_007303.4)，以奶牛DNA为模板，设计F1/R1和F2/R2引物扩增发生可变剪切位置附近的DNA序列：

引物序列F1为：SEQ ID NO.5；R1为：SEQ ID NO.6；

引物序列F2为：SEQ ID NO.7；R2为：SEQ ID NO.8；

25μl PCR体系，PCR反应，然后对产物直接测序，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果，在A2M基因的29和37外显子上发现了两个SNPs位点：c.3535A＞T和c.4520T＞C(NCBI参考序列：NM_001109795.1)；其中，c.3535A＞T是位于扩增片段SEQ ID NO.12第642bp处的单核苷酸位点；c.4520T＞C位于扩增片段SEQ ID NO.14第526bp处的单核苷酸位点，

选择A2M基因序列上鉴别到的2个SNPs位点在338头中国荷斯坦奶牛个体中采用直接测序的方法进行SNP基因分型，采用SAS8.1软件进行关联性分析，通过关联性分析结果，分别发现这2个位点的AA和TT基因型型具有比较高的SCS，根据这2个基因型和SCS的表型有关，筛选出乳腺炎抗性/易感功能性分子标记，通过对奶牛个体基因型的判定，通过标记辅助选择的方法，可选育乳腺炎抗性个体，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；

d：SNPs和可变剪切关系的分析：

为了分析测序发现的SNPs和可变剪切的关系，利用ESEfinder3.0对这2个SNP进行分析，发现这两个SNP正好是位于剪切增强子内ESE，其中，c.3535A＞T突变增加了SC35 and SRp40两种剪切蛋白的结合，c.4520T＞C突变增加了SRp40剪切蛋白的结合，

同时对奶牛DNA进行测序，并且提取它们相应的总RNA，利用RT-PCR和克隆测序技术分析c.3535和c.4520位点的基因型和异常可变剪切体的关系。