[发明专利]转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的检测用的引物和探针。 

背景技术

甘露糖阳性选择系统属于非抗生素筛选系统之一，它是利用大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)作为选择基因，甘露糖作为选择剂进行转基因植物的筛选。甘露糖经由植物内源己糖激酶催化磷酸化为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP和磷酸盐，会导致细胞分裂、生长缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的过量积累对植物细胞有毒害作用。整合有外源PMI基因的转化细胞能将6-磷酸甘露糖异构酶为6-磷酸果糖，使得代谢可继续进行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量积累，并产生ATP，为细胞的正常代谢提供了能量。非转化细胞因缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生长。因此，在含有甘露糖的培养基上，只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞则被淘汰。该选择系统在玉米转基因过程中运用广泛。 

在享有转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。 

目前，国内还没有转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因PCR检测试剂盒，本发明可弥补上述缺陷，采用实时荧光PCR的检测方法完成转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因的检测。 

发明内容

本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的检测用检测方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。 

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：PMI-taqF 5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’和 下游引物：PMI-TAQR 5’-gccgtggcctttgacagt-3’)和一条TAQMAN探针(PMI-TAQP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性集合。Taqman探针的5端标记有报告集团，3端有非荧光淬灭集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团原理淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。 

本发明涉及的转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的检测方法，其中的试剂包括如下： 

(1)PCR扩增反应液A 

包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、0.2-0.6μmol/L Taqman探针； 

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X100； 

上游引物PMI-taqF：5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’；下游引物PMI-taqR：5’-gccgtggcctttgacagt-3’； 

Taqman探针PMI-taqP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA 

其中上游引物、下游引物、Taqman探针的体积比为：1∶1∶0.6； 

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。 

(2)阳性对照DNA