[发明专利]一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法

说明书

技术领域：

本发明属于医学领域，具体涉及一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法。

背景技术：

QT间期指心电图上测量心跳电循环中Q波与T波这个时间段，代表心肌细胞从去极化到复极化整个过程。长QT综合症（long QTsyndrome，LQTs）分为先天性长QT综合症（co ngenital long QT syndrome）和获得性长QT综合症（acquired long QT syndrome）。先天性长QT综合征是因编码心肌细胞膜离子通道蛋白的基因突变导致离子通道功能障碍而引起的。药物是引起获得性长QT综合症的重要原因。当QT间期明显延长时，可能导致尖端扭转型室速（TdP），TdP具有自限性，也可能进一步发展为室颤引起死亡。引起获得性长QT综合症的药物几乎都作用于一种特异性K⁺电流-快速激活的延迟整流钾电流（IKr）。IKr是由位于第7对染色体上的人hERG，(也称KCNH2）基因表达的产物。2005年起，G7各发达国家开始执行由欧盟、日本和美国的药品法规机构和大型制药企业联合制定的关于心脏安全评估的S7B法规。随着时间的推移，S7B法规将会逐渐被各国的药物管理局和制药公司所接受。据统计，25%~40%的先导化合物都显示出不同程度的hERG通道相关的心脏毒性。因此，候选药物的hERG安全性评价是药物开发过程中至关重要的一环。

hERG通道安全性评价作为新药临床前试验一个很重要的部分，经典的检测方法采用膜片钳技术进行评价，该方法实验设备较昂贵，对技术人员的要求较高，且由于手动膜片钳技术自身缺陷使得hERG通道安全性评价效率很低。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有高通量、自动化、高效率、操作简便等特点的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法。

本发明的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

常规培养表达hERG通道的细胞株，然后弃去其培养基，将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下孵育1-4h，然后弃去固定缓冲液，再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育5-40min，再弃去含待检药物的固定缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉残留Rb⁺，然后再加入离子通道开放缓冲液，孵育5-20min，移去细胞上清液，将细胞株裂解得细胞裂解液，分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb⁺浓度；再将上述含待检药物的固定缓冲液中的待检药物设定为其他不同浓度，按照上述方法重复测定，根据不同浓度的待检药物的测定所得的数据，得到该待检药物的IC₅₀值，如果IC₅₀值≤1000μmol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC₅₀值越小，说明该药物对hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。根据《2011药品注册的国际技术要求安全部分》，体外哺乳动物细胞试验的最高浓度为1000μmol/L，因此如果IC₅₀值≤1000μmol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC₅₀值越小，说明该药物对hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大；

所述的固定缓冲液：RbCl 2-10mM，NaCl 120-180mM，CaCl₂ 1-3mM，NaH₂PO₄0.4-1.2mM，MgCl₂0.8-1.2mM，glucose 3-7mM、HEPES 20-30mM，余量为水。每升固定缓冲液的配置方法为：在水中加入RbCl 2-10mmol，NaCl 120-180mmol，CaCl₂ 1-3mmol，NaH₂PO₄0.4-1.2mmol，MgCl₂0.8-1.2mmol，glucose 3-7mmol、HEPES 20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7.4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290–320mOsm。