[发明专利]可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物及其制备方法和在检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及DNA的检测技术领域，尤其涉及一种可用于DNA检测的复合物及其制备方法和在DNA检测中的具体应用。

背景技术

发展一种便携式传感器，用于快速、低成本并且能够在住所或事发地实时定量地检测目标物（例如离子、小分子、DNA、蛋白质、病毒等），是人们长期以来的梦想。此类产品的开发对于科学研究、环境监测、疾病的诊断均具有重要意义。近年来，便携式检测仪器的研究取得了重大进展，尿酸仪和血糖仪等便携式检测仪器已经商业化，基本满足了大众对于某些疾病，在个人疾病诊断和预防方面的需求，改善了数以万计疾病患者的生活。血糖仪和尿酸仪的巨大成功，正体现了人们对于发展便携式传感器的迫切需求。

尿酸为嘌呤代谢的终产物，各种嘌呤氧化后生成的尿酸随尿排出，因溶解度较小，体内含量过多时会形成尿路结石或痛风，另外白血病、肾病、多发性骨髓瘤、恶性肿瘤、真性红细胞增多症等都会在临床上反应出尿酸含量升高。因此，对体内尿酸含量的灵敏检测具有重要的意义（成人体内尿酸的正常含量范围90～420μM），尿酸仪就是应这一需求而发展起来的一种家庭便携式检测仪器。然而，现有的尿酸仪作为一种便携式的尿酸检测仪器，目前仅用于血液中尿酸的检测。

另一方面，DNA的检测方法也开始越来越多地受到人们的重视和关注，在生物学领域有着广阔的应用前景。作为被广泛使用的检测DNA的方法，有PCR（聚合酶链反应）和DNA探针法，这两种方法虽然都可以实现对目标DNA的灵敏检测，但是都需要昂贵的专业仪器设备，且必须在专业实验室内进行。如果能够开发一种利用常见的便捷式检测仪器即可实现DNA检测的方法，这对于本领域技术人员而言，将是一项具有重要意义的革新。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物及其制备方法和在目标DNA检测中的应用，以达到对目标DNA进行便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高的检测目的。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物为长链式分子结构，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子一端为黄嘌呤氧化酶，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于待检测目标基因上的辅助探针，所述黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。

上述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物中，优选的，所述黄嘌呤氧化酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基。更进一步的，所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环1号位上通过羰基与所述黄嘌呤氧化酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：

（a）将0.5mM～2mM的辅助探针（巯基修饰的辅助探针）溶液、0.75M～2M的磷酸盐缓冲液和15mM～60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室温下充分孵育（孵育的时间优选控制在1h～2h），再使用超滤离心管反复离心（优选至少在3次以上）；

（b）将1mg/mL～5mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）振荡混合（二者混合时，要保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，二者摩尔比可以控制在1∶（100～1000），室温下振荡反应完全（振荡反应的时间优选为1h～5h），然后用超滤离心管反复离心（优选至少在3次以上），得到sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液；

（c）将经上述步骤（a）处理后的辅助探针溶液和步骤（b）制得的sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液混合，混合时辅助探针与黄嘌呤氧化酶的摩尔比控制在（5～20）∶1，室温下反应完全（反应时间优选为36h～54h），再用超滤离心管反复离心（优选至少在3次以上），即得到黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。