[发明专利]可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物及其制备方法和在检测中的应用

权利要求书

1.一种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，其特征在于：所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物为长链式分子结构，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子一端为黄嘌呤氧化酶，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于待检测目标基因上的辅助探针，所述黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。

2.根据权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，其特征在于：所述黄嘌呤氧化酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基，所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环1号位上通过羰基与所述黄嘌呤氧化酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。

3.一种黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：

（a）将0.5mM～2mM的辅助探针溶液、0.75M～2M的磷酸盐缓冲液和15mM～60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室温下充分孵育，再使用超滤离心管反复离心；

（b）将1mg/mL～5mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐振荡混合，并保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，室温下振荡反应完全，然后用超滤离心管反复离心，得到sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液；

（c）将经上述步骤（a）处理后的辅助探针溶液和步骤（b）制得的sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液混合，混合时辅助探针与黄嘌呤氧化酶的摩尔比控制在（5～20）∶1，室温下反应完全，再用超滤离心管反复离心，即得到黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，充分孵育的时间控制在1h～2h；所述步骤（b）中，振荡反应的时间为1h～5h；所述步骤（c）中，室温下反应的时间为36h～54h。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中使用的超滤离心管为3K超滤离心管；所述步骤（b）、（c）中使用的超滤离心管为30K超滤离心管；所述超滤离心管反复离心时用到的缓冲液A为0.1M NaCl和0.1M磷酸盐配制成的pH值为7.5的缓冲液；所述超滤离心管反复离心时的重复离心次数至少在3次以上。

6.一种利用尿酸仪检测目标DNA的方法，包括以下步骤：

（1）取一金膜，对其表面进行清洗并吹干，然后在金膜表面铺上已打孔的硅橡胶片，形成反应室；

（2）在所述反应室内加入针对目标DNA设计的捕获探针溶液，温育后再用巯基己醇溶液使所述捕获探针上的非特异性结合位点封闭，构建得到可用于检测目标DNA的传感器；

（3）继续向所述反应室内加入待测目标溶液，杂交反应后用低盐缓冲液反复洗涤；然后加入含权利要求2所述的或者权利要求3～5中任一项制备方法制得的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液，杂交反应后，用低盐缓冲液反复洗涤；

（4）继续向所述反应室内加入黄嘌呤溶液，充分的催化反应后，用尿酸仪对反应后的产物进行检测；如果尿酸仪显示的结果为Lo，则表明待测目标溶液中不含目标DNA或目标DNA的含量过少；如果尿酸仪上显示有信号数值，则表明待测目标溶液中含目标DNA；根据尿酸仪上信号数值的大小可以进一步判断待测目标溶液中DNA的浓度值。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，捕获探针溶液的浓度为1μM～2μM，修饰捕获探针时的温育时间为1h～4h，所述巯基己醇溶液的浓度为0.5mM～2mM，巯基己醇溶液封闭时的温育时间为0.5h～2h。