[发明专利]利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种临床检验用途的基因相对表达量的检测试剂盒，采用Taqman探针实时荧光定量PCR技术，用于检测人类急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内的PML-RARα(L型/S型)融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。 

技术背景

急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyticleukemia，APL)是急性髓系白血病的一种特殊类型，其特异性标志为染色体t(15；17)(q22；q21)易位，形成PML-RARα融合基因。约85％以上的APL患者存在特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，形成PML-RARα融合基因。约95％的PML-RARα基因存在细胞内，是判断APL预后、复发的重要依据，大规模临床调研表明分子学复发的患者在早期给予干预治疗可获得较好的预后。 

PML-RARα融合基因具有异质性，在其形成过程中，RARα上的断裂点总是位于第2个内含子内，但是PML上的断裂点存在很多变异，主要集中在3个断裂点丛集区(bcr)：断裂点bcrl在PML第6个内含子内，形成长型转录本(L)；断裂点bcr2在PML第6个外显子内，产生可变型转录本(V)；断裂点bcr3在PML第3个内含子内，产生短型转录本(S)。其中以长型(L型)和短型(S型)异构体为主，可变型(V型)最少见。通过对PML-RARα融合基因亚型的长期临床观测，L型APL患者的预后优于S型，因此跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现分子复发，及时干预治疗，避免血液学复发，并根据PML-RARα融合基因结果调整治疗方案，这对评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。 

目前临床上已经将PML-RARα融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对PML-RARα融合基因mRNA残留进行检测。 

RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同 时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足PML-RARα融合基因mRNA微量残留的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩增效率和速率均最佳的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒。 

本发明的技术方案如下：其特征在于：它包括下列份数比的物质：红细胞裂解液（50人份，50ml）、TRIzol（Invitrogen公司）（50人份，50ml）、氯仿（50人份，30ml）、无水乙醇（50人份，40ml）、反转录PCR试剂（50人份，0.8ml）、检测体系PCR反应液（50人份，1.15ml）、阳性对照品和阴性对照品； 

其中反转录PCR试剂包括：5×RT buffer（120μl)、RT Enzyme（25μl）、Random Primer（30μl）。