[发明专利]重组质粒pAdTrack-shRNA的测序方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种重组质粒pAdTrack-shRNA的测序方法，具体是关于一种设计特定引物、采用二次PCR以实现对重组质粒pAdTrack-shRNA的测序的方法。

背景技术

RNA干涉（RNA interfering,RNAi）是一种由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PGTS）机制，具有普遍的生物学意义。目前RNA干涉的作用机理还不是十分的明确，一般认为有两个阶段。在RNAi的起始期，双链RNA被细胞内的Dicer酶（RNA酶III家族成员）切割降解成21-23个核苷酸的小片段干扰RNA（siRNA），每个siRNA片段均含有2-3个3’突出端和5’磷酸基团，其5’磷酸末端对mRNA的降解有着重要的作用。在效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物形成RNA导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），在ATP存在的情况下，双链的siRNA解旋，解旋后的siRNA反义链引导RISC到达靶mRNA，通过碱基配对的原则特异性地降解靶序列，从而达到高效特异性沉默目的基因表达。RNA干涉技术能有效、特异性地抑制细胞内特定基因的表达，它在基因功能研究、恶性肿瘤的治疗和神经退行性疾病基因治疗方面可能存在着较高的应用价值。

目前，siRNA的获得主要通过化学合成法和siRNA表达载体法，siRNA表达载体法常用的是质粒表达和病毒表达，目前常用的病毒有腺病毒、逆转录病毒、慢病毒。腺病毒（adenovirus）是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，基因组大小约为36kb，有大约超过50种的腺病毒血清型中，人腺病毒2型及5型研究最为深入，常用作基因转移的载体。因为腺病毒基因组较大，在构建腺病毒载体时，通常将E1区基因切除，把目的基因插入到多克隆位点后与腺病毒骨架质粒共转染293细胞内进行同源重组，得到腺病毒。目前腺病毒载体法是基因治疗中最常用的基因转移方法之一，其具有以下优点：①克隆容量可达10kb，适合容纳较大片段基因；②腺病毒基因的结构和功能比较清楚，易操作和构建；③宿主范围广，能感染分裂状态的细胞与感染非分裂状态的细胞；④病毒滴度高；⑤安全性好。

He等介绍的AdEasy-1系统是通过细菌内同源重组来构建腺病毒载体的一种方法，其具有成功率高、不需要电穿孔等优点而被广泛的应用。但是该腺病毒系统中穿梭质粒pAdTrack，由于多克隆位点前后序列高度重复，目前尚没有一种通用的测序引物，从而限制了该病毒系统在RNA干扰领域中的直接应用。

发明内容

本发明的一个目的在于针对现有技术中对pAdTrack-shRNA的测序难题，提供一种对重组质粒pAdTrack-shRNA进行测序的方法，进而为pAdEasy-1系统直接应用于基因沉默方面奠定基础。

本发明的另一目的在于提供用于实现上述重组质粒pAdTrack-shRNA测序方法的引物对。

为达上述目的，本发明提供了一种重组质粒pAdTrack-shRNA的测序方法，其中是通过设计特定引物、采用二次PCR以实现对重组质粒pAdTrack-shRNA的测序。具体地，该方法包括：

在多克隆位点前后设计上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分别在DNA链上有2个匹配位点，且引物M的2个匹配位点位于多克隆序列的同侧，引物N的2个匹配位点分别位于多克隆序列的两侧；

进行第一次PCR反应，电泳后胶回收含有多克隆位点的目的条带；

以胶回收产物为模板，利用上游引物M和下游引物N进行二次PCR反应，对反应产物进行测序。

siRNA发夹结构可参见图1所示。本发明的间接测序的方法具体原理可参见图2所示：

在本发明的方法中，是于多克隆位点前后设计上游引物M和下游引物N，它们分别在DNA链上有2个匹配位点，即：引物M可以识别A或者A’位点，下游引物N可以识别B或者B’位点。其中引物N的匹配位点在多克隆序列的两侧，引物M的匹配位点在多克隆序列的同侧。进行第一次PCR反应时其产物会出现以下情况的三条带：

1.A点为上游引物识别位点，B’为下游引物识别位点。

2.A点为上游引物识别位点，B为下游引物识别位点。

3.A’点为上游引物识别位点，B为下游引物识别位点。