[发明专利]多基因植物表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体，尤其涉及一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体及其构建方法，本发明还涉及该植物表达载体在转基因植物中的应用，属于植物表达载体的构建领域。

背景技术

目前植物转基因研究主要是转化单个基因，功能单一，作用有限。多基因共同转化已成解决此问题的一条途径。

构建多基因植物转化载体是实现多基因同时转化植物的基础与重要步骤，几乎所有的植物转基因研究都是从构建载体开始。以往多基因表达载体的构建受限制性酶切位点限制，载体携带基因数量少，有些构建过程转化还需要去磷酸化、磷酸化、粘性末端补平等操作，步骤繁琐，难度较高。而有些载体引入了“gateway技术”或采用“归位内切酶结合Cre重组技术”，虽然部分解决上述问题，但也存在成本较高、需要特殊的中间载体、特殊菌株等问题。

发明内容

本发明目的之一是提供一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体；

本发明目的之二是提供一种构建所述植物表达载体的方法；

本发明目的之三是将所述的植物表达载体应用于植物转基因。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体，包括：植物转化载体p209、克隆载体p6435x和待转化的一个或多个目的基因；

其中，p209为Ti质粒，源自载体pBI121，在原有pBI121载体的HindIII与Eco RI两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段；p209载体上有Bsp120 I与Xba I两个限制性内切酶位点；p209带有植物筛选基因npt II。

所述克隆载体p6435x起源于原核表达载体pET28a；该载体带有CaMV35S启动子及NOS终止序列，二者之间有2个Eam1105 I酶切位点，经单酶切形成T载体与目的基因PCR产物相连，构成完整的目的基因开放阅读框（ORF），分别在开放阅读框的两侧依次携带有酶切位点Not I与Bsp120I、Spe I及Nhe I酶切位点。

本发明的另外一个目的是提供一种构建所述携带单个或多个外源基因的植物表达载体的方法，包括以下步骤：

（1）分别构建植物转化载体p209和克隆载体p6435x；

（2）用内切酶Eam1105 I酶切克隆载体p6435x产生2个含T的3’突出端，形成T载体，与带有含A的3’突出端的第1个目的基因PCR产物相连，将第1个目的基因扩增片段完整并正向连入克隆载体中，构建成包括CaMV35S启动子+目的基因+NOS终止序列的开放阅读框；利用Not I与Nhe I双切携带目的基因表达开放阅读框（ORF）的克隆载体，回收第1个目的基因表达开放阅读框（ORF）片段，备用；

（3）利用Bsp120 I与Xba I双切p209，回收p209酶切片段；将p209酶切片段与步骤（2）回收的第1个目的基因表达开放阅读框（ORF）片段连接，p209上原有的Bsp120I与Xba I位点及目的基因表达开放阅读框两端的Not I与Nhe I位点消失，而新和成的植物表达载体上带有的Bsp120I与Spe I位点，经过酶切又可以与第2个带有Not I与Nhe I位点的目的基因表达开放阅读框（ORF）片段相连，如此不断重复，构建出携带多个目的基因的植物表达载体。

其中，所述的植物转化载体p209的构建方法包括：在pBI121载体的Hind III与EcoRI两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段，即得。

p209为Ti质粒，源自载体pBI121。自身带有植物筛选基因npt II，用于植物转化。在原有pBI121载体的Hind III与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段。p209载体上有Bsp120I与XbaI两个限制性内切酶位点，经内切酶Bsp120 I与Xba I双酶切后，会产生两个不同的粘性末端，与克隆载体上相应同尾酶末端片段连接后，位点会消失。

所述克隆载体p6435x的构建方法包括：先从载体pCAMBIA1302上克隆了带有CaMV 35S启动子、gfp绿色荧光蛋白基因及NOS终止序列并引入了新酶切位点的片段；用一个两端都带有Eam1105 I位点的片段取代gfp绿色荧光蛋白基因，形成一个新片段，再通过酶切、连接把新片段连到pET28a上得到克隆载体p6435x。

可以采用诸如热激法等方式把本发明所构建的植物表达载体转化农杆菌感受态。利用农杆菌介导法转化植物，经过卡那霉素（Km）抗性筛选，获得转基因植株。