[发明专利]乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种新型的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片、试剂盒及方法。 

背景技术

目前国内外对于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染患者的主流治疗方案是抗病毒长期治疗。HBV是一种突变率极高的病毒，自然突变率10^10-11点突变/天，在长期药物治疗特别是核苷类似物药物如拉米夫定等选择压力下，HBV耐药突变发生频率高，临床耐药突变成为影响慢性乙肝治疗效果的主要因素。 

拉米夫定是治疗慢性乙肝最常用的核苷类似物药物，但研究发现随着用药时间的延长患者发生病毒耐药变异的比例增高，第1、2、3、4年分别为14%、38%、49%和66%，从而限制其长期应用。部分病例在发生病毒耐药变异后会出现病情加重，少数甚至发生肝功能失代偿。因此用拉米夫定治疗慢性HBV感染患者，要用多长疗程，何时发生耐药、需要停换药物，这是临床医生考虑的难点。替比夫定和拉米夫定的耐药位点相同，95%以上对拉米夫定和替比夫定的耐药突变都发生在rtL180M和rtM204V/I位点，，一小部分病人的耐药突变发生在rtA181T/V位点，rtA181T/V位点与阿德福韦有交叉耐药。 

阿德福韦酯是治疗慢性乙肝最常见的核酸类似物药物，其治疗乙型肝炎病毒e抗原（HbeAg）阳性患者的第1、2、3年耐药发生率分别为0%、1.6%和3.1%；治疗HBeAg阴性患者的第1、2、3年耐药发生率分别为0%、3.0%和5.9%-11%。虽然总的耐药发生率较拉米夫定降低不少，但其耐药发生后造成的危害同样非常严重。目前已证实阿德福韦耐药相关的变异主要包括rtA181V/T和rtN236T。 

拉米夫定耐药患者如加用阿德福韦治疗，可降低对阿德福韦的耐药率。因此，对拉米夫定耐药患者，目前倾向于采用拉米夫定和阿德福韦联合治疗。值得注意的是，拉米夫定和阿德福韦联合治疗有可能选择出对拉米夫定和阿德福韦同时耐药的HBV毒株。拉米夫定耐药（rtM204I）的患者换用阿德福韦治疗，在出现阿德福韦耐药（rtN236T）后加用拉米夫定，虽然出现了HBV DNA的下降，但是同时出现了拉米夫定和阿德福韦联合耐药株（rtL180M+rtM204V+rtA181V）。 

1989年由Saiki等提出了反向斑点杂交（reverse dot blot，RDB）技术，该技术是在PCR技术的基础上进行了一个实用性的改进。Saiki及其同事在检测HLA时提出了一个有效的改进，该方法是将靶基因在PCR过程用放射性元素标记，然后与尼龙膜杂交，从而检测靶基因的突变情况。这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高了检测的效率。随后，其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变，利用共价键的探针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法，RDB技术的稳定性有了明显的提高。目前Inogenetics的LiPA系列产品（通过CE认证）均是基于上述的原理。 

从技术原理来说，RDB在本质上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一种，但它不同于一般所说的玻璃DNA芯片，其信号特异性强，简便易行，技术要求低，仪器设备投入小，检测结果用肉眼就可直接判断，而无需购买昂贵的激光扫描仪，更符合中国目前的国情也更利于在基层医院推广。 

目前我国还没有经国家食品药品监督管理局（SFDA）正式批准的能检测常用药物耐药基因突变的产品。这种供求的矛盾在乙型肝炎高发的发展中国家尤为突出，一方面不明确的治疗手段在长期治疗过程中给患者带来沉重的经济负担，另一方面也使得乙型肝炎的控制变得越来越难。所以，临床迫切需要一种检测HBV耐多药突变基因型的手段，以便在指导合理用药的同时对病程进行预测，不断提高诊疗的有效性。 

发明内容

本发明的技术方案为提供一种乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针序列如下所示： 

探针180L：NH₂-5′-GTTTCTCYTGGCTCAGTT-3’; 

探针180M：NH₂-5′-GTTTCTCATGGCTCAGTT-3’; 

探针204M：NH₂-5′-GCTTTCAGTTATATGGATGATG-3’; 

探针204V：NH₂-5′-GCTTTCAGTTATGTTGATGAT-3’;