[发明专利]基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环境科学与工程、环境保护技术领域。

背景技术

现阶段国内外常用于检测和鉴定致病微生物的方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、常规PCR等一些简单的分子生物学和免疫学方法。

传统生化鉴定法（如分离培养、生化鉴定等）应用最广泛，是《食品卫生微生物学检验（GB/T 4789-2003）》等国标检测程序，该方法能够得到样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果，由于操作简单、经济且准确性好而被广泛采用，但是大都需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定4个步骤，整个过程通常需要3~7天，检测周期长，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落，另外，培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测都增加了实验室的工作量，并且检测灵敏度低，不能实现有效的实时快速监测和防控。

免疫学检测技术主要是采用酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定，基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。该方法可检测沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌O157等致病微生物。免疫学检测技术简单、方便，较传统检测技术迅速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。

聚合酶链式反应（Ploymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增技术，其基本原理是在体外适宜的条件（如镁离子浓度）和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），以目标基因组DNA上正、反相两引物间的特定的双链DNA片段（或称靶DNA）进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25~35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍，经琼脂糖或聚丙烯酰氨凝胶电泳和染色剂如溴化乙锭（EB）染色后在紫外光下观测到相应的条带。常规PCR虽为一种特异灵敏、简便快速的检测技术，但该方法需要较长时间的样品纯化处理过程，且一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性；同时，一次一般只能检测一种致病微生物。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测和鉴定致病微生物方法存在的以上不足，提出一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法，采用多重PCR一次性同时扩增13种致病微生物的特异性基因片段：大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

所述方法具体包括以下步骤：

（1） 水样处理

采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌（浓缩仪采用Milliflex Plus浓缩仪），然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；

（2）DNA模板提取

采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒或者与之有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒进行核酸提取，取10uL样本DNA进行下一步程序；

（3）多重PCR扩增目的片段

采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，浓度为2.5 mmol/L dNTP  0.1－0.3μL，浓度为10－20μmol/L的各种（即13种病原微生物）引物混合液0.4－0.8μL，50 ×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL； 

PCR循环参数：95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；4℃保存备用；

（4）电泳检测