[发明专利]一种脱细胞心包材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于心包材料的制备领域，特别涉及一种脱细胞心包材料的制备方法。

背景技术

组织工程研究是制造人体器官和组织的科学，由于其广阔的应用前景和逐年以几何级数递增的产业效益，各国政府和产业界都投入巨资进行研究和产业建设。世界每年的研究经费都在几十亿美元以上。组织工程研究包括两个主要方面：一方面是用来构建成器官和组织形态的支架；另一方面是种植在支架上可以生长并发挥生理作用的细胞。而对于组织工程支架，它必须具备两个特点：（1）对细胞具有良好的亲和性；（2）对人体无毒害、无免疫反应，可在人体内降解。

细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是各种组织器官的主要组成成分，构成了各种组织器官的三维空间结构和营养物质的储存，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用，即使经过脱细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境，这是其他人工聚合物（如胶原、壳聚糖、聚乳酸和聚羟基乙酸等）所不能比拟的。心包是包裹心和出入心大血管根部的纤维浆囊膜，可分为纤维层、浆膜层和外结缔组织层，主要由细胞和ECM组成，其中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应，需要通过脱细胞处理来去除抗原物质，ECM由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成，含有少量的弹性纤维、氨基聚糖和糖蛋白等，其组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好，是一种理想的组织工程生物支架材料。

目前脱细胞处理方法主要包括物理法、化学法和酶处理法。物理的处理方法有很多，主要是通过物理的作用如冻融、液体高压、超声波和电击等脱除细胞，但物理方法对ECM的破坏作用较大。化学方法就是使用一些特定的化学试剂如酸、碱和去污剂等破碎细胞达到去除细胞的目的，但化学试剂的残留会对机体产生毒害作用。酶处理方法主要是指用酶试剂来裂解细胞，例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶，但胰蛋白酶对ECM有降解的作用。且这些脱细胞方法过程繁琐，处理时间长，不利于批量生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种脱细胞心包材料的制备方法，该方法简单，成本低，彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片，制备出具有较好的力学性能和生物学特性的生物支架材料。

本发明的一种脱细胞心包材料的制备方法，包括：

（1）前置处理：取健康成年动物的心脏，割取心包膜，热缺血时间小于1小时；然后在0-37℃下用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜，以去除血凝块后，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液充分漂洗，得到处理后的包心组织；

（2）脱细胞处理及清洗：将上述处理后的包心组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，破坏细胞膜结构和抽提细胞膜的脂质和膜蛋白；再经过核酶处理，以降解细胞中各类DNA和/或RNA成分，最后清洗即可。

步骤（1）中所述的成年动物为猪或牛。

步骤（1）所述的片状的尺寸为6cm×8cm。

步骤（1）得到的处理后的包心组织于4℃下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。

上述的双抗溶液为100倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液（配制的双抗溶液为100倍的浓缩液，实际工作浓度为稀释100倍后的浓度，青霉素的工作浓度范围为50-5000U/ml，硫酸链霉素的工作浓度范围为1-100mg/ml）。

步骤（2）中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的体积浓度小于50%。

上述的烷基糖苷（也称为烷基葡萄糖苷、烷基多糖甘）通常为50%含量的水溶液，有0810、0814、1214、0816、1216、1618等型号，可以是烷基糖苷系列中的任一种或一种以上。

步骤（2）中所述的低渗处理为采用浓度为0.01M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm。

步骤（2）中所述的高渗处理为采用浓度为0.05M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm。