[发明专利]一种细菌传递的非注射型DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的非注射型DNA疫苗。

背景技术

DNA疫苗也称为核酸疫苗或基因疫苗。这种疫苗是将编码病原的某种抗原基因克隆于一个真核表达载体，由此获得重组表达质粒，即DNA疫苗。DNA疫苗注射到所要免疫的动物体内后，其携带的抗原基因即可在动物体内表达，由此产生的抗原即可诱发机体的免疫反应，使得受免动物获得特定的免疫保护。DNA疫苗的优点是安全，并且免疫效应较好，因此是一种具良好发展潜力的疫苗形式。然而，由于DNA疫苗的导入方式通常是注射，因此在应用上具有注射型疫苗的所有局限。如何既保持DNA疫苗的优点又克服其注射应用的缺点是一个需要解决的问题。

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是重要的水产养殖病原菌。这两种细菌皆能感染多种海水和淡水鱼类，包括我国重要的经济品种牙鲆和大菱鲆，从而给养殖业造成严重的经济损失。

发明内容

本发明目的在于提供一种细菌传递的非注射型DNA疫苗。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种细菌传递的非注射型DNA疫苗，以迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM作为传递载体，传递海豚链球菌DNA疫苗pCNSi10菌株的细菌传递的非注射型DNA疫苗。

所述细菌传递的非注射型DNA疫苗为将海豚链球菌DNA疫苗pCNSi10菌株转化入迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。

所述DNA疫苗菌株TX5Si可作为制备迟缓爱德华氏菌和/或海豚链球菌的DNA疫苗。

本发明具有如下优点：

1.制备简单。本发明的疫苗只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。

2.非注射型应用。本发明的疫苗具有减毒疫苗和DNA疫苗的共同优点，可以通过浸泡和口服方法导入，从而避免了常规的注射型DNA疫苗的缺点。

3.交叉保护效应。本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

非注射型DNA疫苗的构建

步骤1)海豚链球菌DNA疫苗pCNSi10的构建：以质粒pACYC184(购于北京New England Biolabs公司)为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，63℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用“天根生化科技(北京)有限公司”DNA产物纯化试剂盒纯化。PCR产物纯化后与载体pBS-T(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSSi。将质粒pBSSi和质粒pSia10(pSia10构建见参考文献Cheng S，Hu Y，Jiao X，Sun L.Identification and immunoprotective analysis of a Streptococcus iniae subunit vaccine candidate.Vaccine 2010；28：2636-41)用限制性内切酶BamHI酶切，分别回收0.9kb和6kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pCNSi10。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；

所述引物为F1：5’-ATGGATCCAGGAGGGACAGCTGATA-3’和Ri：5’-GGATCCGAATGCACCAATAACTGCCT-3’。