[发明专利]一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗。 

背景技术

基因克隆技术已有40多年的良好应用，它包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 

亚单位疫苗具有许多特点：（1）亚单位疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使用；（2）是一类新型疫苗，是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗。（3）去除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，有效地增强了疫苗的免疫原性并且减少了副作用。 

嗜水气单胞菌(Ah)是我国水产养殖业的重要威胁之一，它是人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌，亦可引发人类的腹泻或败血症等，对食物安全具有威胁，并且是抑制病人免疫系统功能和肝功能。该菌的致病性与其众多的毒力因子密切相关，其中胞外蛋白酶为最常见的毒力因子之一，它具有吞噬作用，能够刺激机体产生特异性抗体，与Ah的致病性和机体的免疫保护作用密切相关，一直是研究嗜水气单胞菌疫苗的焦点。而利用Ah的毒力基因胞外蛋白酶制备的重组亚单位疫苗，目前尚无相关报道。 

发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效控制嗜水气单胞菌感染的重组亚单位疫苗，可为嗜水气单胞菌的防控提供有力的支持。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种重组质粒pET32a-epr2-3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoR I酶切位点之间插入嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I和Sal I酶切位点间插入嗜水气单胞菌的epr2基因，其中所述的epr3基因GenBank登录号为EU275147.1，epr2基因GenBank登录号 为CP000462.1。 

所述的重组质粒pET32a-epr2-3优选通过如下方法制备得到： 

（1）epr2和epr3基因的克隆：以保藏号为CGMCC NO.3220的嗜水气单胞菌J-1株的DNA为模板，分别以引物Epr2-1/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3-2通过PCR扩增，得到epr2基因和epr3基因，将其分别插入pMD-18T质粒，得到pMD-18T-epr2和pMD-18T-epr3； 

（2）重组质粒pET32a-epr3的构建：利用Kpn I和EcoR I对pMD-18T-epr3和pET32a分别进行双酶切，将获得的epr3基因酶切产物插入pET32a的Kpn I和EcoR I酶切位点之间，得到重组质粒pET32a-epr3； 

(3)重组质粒pET32a-epr2-3的构建：利用EcoR I和Sal I对pMD-18T-epr2和pET32a-epr3分别进行双酶切，将酶切产物epr2基因插入重组质粒pET32a-epr3的EcoR I和Sal I酶切位点间，得到重组质粒pET32a-epr2-3。 

含有所述的重组质粒pET32a-epr2-3的宿主。 

所述的宿主优选细菌或细胞，进一步优选大肠杆菌BL21。 

一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白由所述的含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21所分泌。 

所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，优选将含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21接种于LB培养基中，振荡培养后加入0.1M IPTG诱导蛋白表达，继续培养后离心获得菌体，超声破碎后离心获得上清和包涵体，对包涵体进行变性溶解，再分别取两者以His亲和层析柱纯化重组蛋白，收集所得即为重组蛋白Epr2-3。 

所述的重组质粒pET32a-epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。 

所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。 

一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗，含有所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3及佐剂。 

所述的佐剂优选弗氏完全佐剂或DC-Chol佐剂。 

有益效果：