[发明专利]一种肽聚糖单克隆抗体的制备及其产品

说明书

所属领域：生物医药范畴，确切说是一种肽聚糖的单克隆抗体制备的方法及相关应用于临床诊断革兰氏阳性菌的产品。

背景技术：经初步检索，未查到以金黄色葡萄菌提取的肽聚糖等天然抗原来免疫小鼠，制备单克隆抗体专利，并且临床没有针对革兰氏阳性菌感染快速检测手段。

发明内容：

填补国内革兰氏阳性菌肽聚糖单克隆抗体的空白，为临床诊断革兰氏阳性菌感染提供参考，本发明的肽聚糖单克隆抗体，不仅能够检出金黄色葡萄球菌的肽聚糖，而且对革兰氏阳性菌肽聚糖具有广谱性和对革兰氏阴性菌肽聚糖不发生特异性反应的特征。

本发明的技术方案是：以金黄色葡萄球菌出发菌株，采用青霉素钠诱导法和葡聚糖G-100(Sephadex G-100)凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌肽聚糖。以此为免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠，通过有限稀释法获得亚克隆细胞株，通过亚类鉴定获得3株IgG1和1株IgM单克隆细胞株，将获得的4株单克隆细胞株培养后，注入小鼠腹腔内(提前一周注射降植烷)。10-15天，取小鼠腹水，通过硫酸铵沉淀提取方法结合亲和层析纯化技术来纯化IgG抗体，通过聚乙二醇沉淀提取和凝胶层析纯化IgM抗体。将4株抗体通过间接酶联免疫方法筛选出具有广谱性的1株单克隆抗体，通过间接竞争法来测定抗体的特异性良好，以这株单克隆抗体建立用于检测革兰氏阳性菌肽聚糖间接竞争酶联免疫试剂盒。

本发明的有益效果是，确定了血清及其它体液的预处理方法，得到的单克隆抗体可以为临床快速诊断的革兰氏阳性菌感染提供参考和数据支持。

附图说明：

图1是肽聚糖提取流程图；

图2是纯化的肽聚糖抗原的Sephadex G-100凝胶柱的分离图；

图3是4株单克隆抗体纯化后非变性电泳图；

图4是4株单克隆抗体对沙克乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌来源的肽聚糖交叉反应率图；

图5是3F8对金黄色葡萄球菌肽聚糖、大肠杆菌脂多糖、酵母菌1，3-β-D-葡聚糖和大肠杆菌肽聚糖的交叉反应率图；

图中A是金黄色葡萄球菌肽聚糖，B是大肠杆菌脂多糖，C是酵母菌1，3-β-D-葡聚糖，D是大肠杆菌肽聚糖。

具体实施方式：

先参照说明书附图将本发明内叙述如下：

一、金黄色葡糖球菌菌株的来源：

金黄色葡萄球菌购买自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏管理中心。

二、金黄色葡萄球菌的培养

1.金黄色葡萄球菌培养基配方：

(1)7.5％Nacl肉汤培养基：

用5NNaOH调pH值至7.6，定容至1000ml，115℃灭菌20mi0高压蒸气灭菌，4℃保存。

(2)基本培养基：

用5NNaOH调pH值至6.8，过滤灭菌，4℃保存。

2.金黄色葡萄球菌培养条件

37℃，200rpm，培养18个小时。

三、金黄色葡萄球菌抗原的提纯

肽聚糖抗原的纯化主要包括以下几个步骤，见说明书附图1：

1.增菌培养：取金葡菌ATCC 25923单个菌落接种于1000ml 7.5％Nacl肉汤培养基中，37℃、200转/min振荡培养18h，此时细菌为对数生长期，菌液浓度约2～5×10⁸CFU/ml；

2.高速冷冻离心机1500转/min、30～37℃、15min离心，收集细菌沉淀，PBS洗3次；

3.尽快将沉淀转到37℃基本培养基(1L)中，放置于37℃恒温电培养箱中5min，此时混合液OD660约1.4～1.6；

4.加入37℃青霉素溶液(10mg/ml)7.5ml，37℃、200转/min振荡1h；

5.95℃、30min进行灭菌；

6.1500转/min、4℃、20min离心，收集上清；上清再6500转/min、4℃、20min离心，收集上清；

7.上清超滤：通过0.22um滤膜；

8.旋转蒸发仪浓缩至100ml左右，4℃冰箱冷存备用；

9.葡聚糖G-100凝胶柱的制备：称取葡聚糖G-10015g，加到300ml蒸馏水中，100℃水浴3h。然后，将冷却的混悬液缓慢加入柱内，根据AKT-HPLC分析仪压力要求进行装柱。用三蒸水平衡凝胶柱，调流速0.5～1ml/min；