[发明专利]革兰氏阳性细菌核酸提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种革兰氏阳性细菌核酸提取方法。

背景技术

细菌是引发大多数感染性疾病的病原体，引起临床细菌感染的致病菌均分为革兰氏阳性菌和阴性菌二大类。目前为止，在人类感染的细菌谱中虽然革兰氏阴性菌仍占有主要地位，但是革兰氏阳性菌的感染率却有着逐年增加的趋势，现已可占到全部细菌感染的30-40%，其中95%为凝固酶阴性葡糖球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌。无论是用于致病微生物检测的分子诊断技术，还是用于细菌分子生物学研究的转录组研究技术，其第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸（包括RNA和DNA）的提取，这直接影响着这些检测技术的结果。

众所周知，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁等结构有着很大的差别，革兰氏阳性菌由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取（尤其是RNA）方面，效果一直不很理想。目前革兰氏阳性菌的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用的破壁方法主要包括：超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前被广泛采用的市场销售的细菌RNA提取试剂盒产品是Invitrogen公司的RiboPure^TM-Bacteria试剂盒和QIAGEN公司的PureLink^TM RNA Mini试剂盒等。这些试剂盒的价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从各种革兰氏阳性菌中高效、快捷的提取核酸，已成为了目前分子诊断技术和转录组研究等技术推广和应用的一个瓶颈。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂。

本发明提供的试剂，由提取液A和提取液B组成；

所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.05%-0.2%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1-0.5%（体积百分含量）；

所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为（99-98）∶1∶1。

所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；

所述提取液A的pH值为7.2-7.8，所述提取液A的pH值具体为7.5；

所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7.5。

所述提取液A中，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%；

所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%；

所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98∶1∶1。

本发明的第二个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

先将所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。

所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为1μg-5g∶400μl∶400μl，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg∶400μl∶400μl。

所述反应时间为12-18min；所述反应时间具体为15min；

所述反应温度为60-70℃；所述反应温度具体为65℃。

所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；

所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；

所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。