[发明专利]革兰氏阳性细菌核酸提取方法

权利要求书

1.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；

所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.05%-0.2%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1-0.5%（体积百分含量）；

所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为（99-98）∶1∶1。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：

所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；

所述提取液A的pH值为7.2-7.8，所述提取液A的pH值具体为7.5；

所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7.5。

3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：

所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%；

所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%；

所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98∶1∶1。

4.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法，包括如下步骤：

先将权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为1μg-5g∶400μl∶400μl，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg∶400μl∶400μl。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

所述反应时间为12-18min；所述反应时间具体为15min；

所述反应温度为60-70℃；所述反应温度具体为65℃。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述离心的温度为0-4℃；所述离心的温度具体为4℃；

所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；

所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10cm。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤：将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4℃，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为0℃，所述静置时间具体为5分钟。

9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：所述混合的方式采用震荡混匀，所述混合的时间为10-15分钟；所述混合的时间具体为15分钟。

10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于：在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。

11.根据权利要求4-10中任一所述的方法，其特征在于：

所述上层水相与所述氯仿的体积比为1∶（0.8-1.5），所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1∶1。