[发明专利]血小板形态扫描成像和血小板活化功能评估的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血小板形态扫描成像和血小板活化功能评估的方法。

背景技术

血小板是血液中具有特定的形态结构和生化组成的有形成分之一,其主要生理功能是参与凝血与止血。血小板结构复杂且个体差异较大，因能运动和变形，往往表现为多形态。循环血液中正常状态的血小板呈椭圆形或圆盘形，平均直径约2～4微米。血小板易受机械、化学刺激而活化并导致形态改变。当血小板一旦与创伤面或激活剂接触，可扩展成为圆片状血小板，以增加凝血与止血的面积。凝血酶、ADP、肾上腺素和胶原等都是血小板的激活剂。任何凝血与止血过程也都涉及血小板的活化，因此通过体外实时检测激活剂作用下血小板形态的变化，即可直观评估血小板的生理功能。目前用于检测血小板形态的方法和仪器种类较多，其中普通光学显微镜及激光共聚焦显微镜的分辨率仅能达到200纳米左右，不能满足血小板微观形貌高分辨率观测的需要。扫描电镜（SEM）尽管具有足够高的分辨率，但需要对血小板进行固化和特别处理以实现样品的导电性，这势必会改变、甚至破坏血小板表面的微观结构，因此根本不适合活体血小板的观测。而扫描探针显微镜家族中作为高分辨率生物成像研究有力工具的原子力显微镜（AFM），已被用于血小板微形貌的三维拓扑结构研究，但由于其利用探针针尖与血小板膜间的相互作用力进行负反馈控制以实现扫描成像，扫描中探针与活体血小板的轻微接触不可避免，不仅会损伤血小板的表面结构，其机械作用力也可激活血小板引起形态变化，因此也不能满足血小板激活剂作用前后微形貌成像的需要。

为了克服原子力显微镜需要扫描探针与样品接触而损伤或激活生物样品的缺点，加州大学的Hansma教授于1989年发明了非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanning ion conductance microscopy,SICM)，由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品接触并导致针尖或样品损坏，SICM技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的聚酯薄膜扫描成像。近年来SICM技术通过改进定位及扫描控制技术实现了在生理液态培养条件下实时、非接触式地对活体生物样品表面三维微观结构的探测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种血小板形态扫描成像的方法。

本发明的第二个目的是提供一种血小板活化功能评估方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种血小板形态扫描成像的方法，包括如下步骤：

（1）血小板样品的制备

取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200μL所述富血小板血浆放置于涂覆有200μL浓度为2mg/mL的纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入1.5-2mLPBS缓冲液后备用；

（2）将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤（1）获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤（1）获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；

（3）用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。

一种血小板活化功能评估方法，包括如下步骤：

（1）血小板样品的制备

取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200μL所述富血小板血浆放置于涂覆有200μL浓度为2mg/mL纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入1.5-2mLPBS缓冲液后备用；

（2）将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤（1）获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤（1）获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；

（3）用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图；

（4）再向细胞培养皿中加入激活剂，作用10-20分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂10-20分钟血小板表面形貌的三维拓扑结构图。