[发明专利]一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酰胺转氨酶，特别是一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。但由于MTG自身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了MTG的应用范围。因此基于已得到的MTG在大肠杆菌中的表达平台，利用氨基酸缺失和饱和突变，对MTG进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的MTG。

发明内容

为改善MTG比酶活低，热稳定性差的现状，本研究通过对MTG的N端氨基酸进行缺失，从而降低底物与MTG活性中心的结合阻力，提高MTG对底物的亲和能力。对得到比酶活提高的突变株继续利用饱和突变，改变MTG内部氨基酸之间的极性作用，继而提高MTG比酶活和热稳定性。本研究提供一种新的改造思路，结合理性设计和饱和突变，提高改造效率，并得到了比酶活和热稳定都提高的突变株。

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyces hygroscopicus CCTCC NO.M203062），通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genebank：EU477523），并实现了MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达（Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W，Chen K,Liu Y，Du G，Chen J,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretion by Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett 324(2):98-105）。基于大肠杆菌构建平台，我们对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株。

本发明所用到的培养基：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；

TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH₂PO₄，72mmol/LK₂HPO₄。

本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定：

比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37C时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。

试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL 0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。

试剂B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL₃按1：1：1混合。

配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL)=(6.8548×OD₅₂₅-0.0164)×稀释倍数

本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

附图说明

图1S.hygroscopicus来源MTG晶体结构模拟

图2TGase N端缺失发酵上清(A)和纯化蛋白SDS-PAGE(B)

图3饱和突变株发酵上清酶活和热稳定性检测