[发明专利]一种肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

手足口病是一种全球性传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，在少数患者中可引发心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎等致命性并发症。在我国，1981年在上海首次发现手足口病；此后，全国各地都有发病报道。有些地区的流行率高达1000/10万。

目前已确认的引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，埃可病毒11型以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。

目前EV71的主要检测方法有：病毒分离培养法、血清学检查和RT-PCR法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。RT-PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的肠道病毒71型(EV71)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合，在有EV71内标(EV71 IC RNA)时，其最好还可与该EV71内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述EV71扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述EV71检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV71检测探针存在于一EV71检测液中。

再进一步所述试剂盒还包含有EV71内标和内标检测探针；所述EV71内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与EV71靶标核苷酸(EV71 RNA)使用同一对引物(T7和nT7)，EV71内标由序列表中序列7所示的EV71 IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于EV71检测液中。

更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；