[发明专利]牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法

权利要求书

1.一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，其特征在于：在质粒pcDNA3.1结构的Mun I与BamH I两酶切位点之间插入有质粒pBC1的Mun I与BamH I的酶切片段，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；在载体pcDNA3.1-In的BamHI与Pme I两酶切位点之间插入有合成好的牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5及牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3；载体pcDNA3.1-In的BamH I酶切端连接牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5；载体pcDNA3.1-In的Pme I酶切端连接牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3，其中as1-5另一末端携带Not I酶切位点，as1-3另一末端携带Xho I酶切位点，Not I和Xho I酶切位点作为目的基因插入位点。

2.根据权利要求1所述的一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，其特征在于：所述牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2；所述牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。

3.根据权利要求1或4所述的一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，其特征在于：所述载体在抗性标记基因两侧含有两个Loxp位点，可与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除。

4.一种用于权利要求1所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：

(1)通过Mun I和BamH I两种酶，将pBC1中包含绝缘子的一段长3658bp基因切下；

(2)将步骤(1)的酶切产物回收片段插入Mun I和BamH I两种酶切后的pcDNA3.1载体中，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；

(3)合成包含有启动子、外显子1、2以及内含子1、2的长为4919bp的牛α酪蛋白5′端序列，在合成的基因两端分别加入BamH I及Not I酶切位点，得到αs1-5；

(4)合成包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子的长为2339bp的牛α酪蛋白3′端序列，在合成的基因两端分别加入Xho I以及Pme I酶切位点，得到αs1-3；

(5)将合成好的α酪蛋白调控基因αs1-5、αs1-3插入到pcDNA3.1-In载体BamHI与Pme I两酶切位点之间，构成牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1。

5.根据权利要求6所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)至(5)中任一步都采用胶回收酶切产物。

6.根据权利要求6所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)或(5)都采用转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定pcDNA3.1-In载体或pBC-αs1载体的得到。