[发明专利]一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法。 

背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐弧菌，广泛的存在于温暖的水体环境中，其在河口、海洋环境里是较常见的致病菌。主要通过污染海产品和感染伤口而感染健康人畜，创伤弧菌能够引起败血症和伤口感染。近年来有由于食用被创伤弧菌污染的海产品而发生胃肠炎的相关报道，主要症状为呕吐、腹泻以及腹部疼痛。由创伤弧菌引起伤口感染的病死率高达50％，由创伤弧菌感染引起败血症的病死率高达75％，尤其是在免疫抑制的病人和体内荷铁量过多的人群中。在腹泻病监测中，常不能从标本中分离到法定传染病中监测管理的甲类和乙类肠道感染病原菌以及沙门菌等，使得对病原的确认带来困难，其中一个原因是缺乏对其它致腹泻病原菌的有效检测手段，并且，随着近年海产品食用量的增加、由创伤弧菌引起病例增加以及创伤弧菌感染的高病死率，迅速建立一种能够快速检测创伤弧菌的方法显得至关重要。 

创伤弧菌的常规检测方法有分离培养、生化鉴定以及核酸杂交。随着分子生物学技术的发展，PCR技术以及荧光PCR技术已经被广泛的应用于病原菌的检测。有许多研究介绍了借助常规PCR和(或)实时PCR检测能够作为创伤弧菌生物标记的溶血素基因(V.vulnificus hemolysin A，vvhA)来鉴定创伤弧菌的方法。如Mark S.Campbell根据创伤弧菌溶血素基因(vvhA)建立了基于SYBR Green的实时PCR检测方法，但该方法需要借助溶解曲线来区分特异性扩增和非特异性扩增，特异性不高。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、省时、 特异性好、灵敏度高的利用TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法。 

为实现上述目的，本发明一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，该非诊断性方法包括： 

以创伤弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列： 

tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactat 

gacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtg 

aaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttat 

ggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactgg 

aatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgat 

ctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaac 

ggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttac 

cgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtc 

gaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa； 

设计创伤弧菌实时PCR引物和探针： 

进一步，所述扩增产物的序列及引物和探针的位置如图8所示。 

进一步，所述探针VVH-P的5’端所标记荧光素为FAM，探针3’端连接淬灭基团。 

进一步，所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。 

进一步，所述该非诊断性方法包括步骤： 

1)提取细菌染色体DNA； 

2)实时荧光RT-PCR反应，配制PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中； 

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增； 

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。 

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下： 

循环条件：