[发明专利]一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法

权利要求书

1.一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

以创伤弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列：

tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactat

gacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtg

aaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttat

ggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactgg

aatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgat

ctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaac

ggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttac

cgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtc

gaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa；

设计创伤弧菌实时PCR引物和探针：

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述扩增产物的序列及引物和探针的位置如图8所示。

3.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述探针VVH-P的5’端所标记荧光素为FAM，探针3’端连接淬灭基团。 

4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。

5.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)提取细菌染色体DNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

6.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

7.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述VVH-F和VVH-R浓度均为200nmol/L。

8.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述VVH-P探针浓度为100nmol/L。

9.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，反应温度为60℃。